摘要
目的: 本研究主要探讨克罗恩病(Crohn''s Disease，CD)患者中是否存在肠道菌群失调与脂质代谢异常，并探索这些因素能否诱导克罗恩病发生发展，为CD发病机制以及病因探索的研究提供新的证据与思路。 方法: (1)收集12对CD患者溃疡病变结肠组织、CD患者非病变的结肠组织标本以及与取材处相对应的肠系膜脂肪组织(Mesenteric adipose tissue,MAT),进行HE染色，观察比较组织结构、炎症细胞浸润程度等病理学表现，qPCR检测MAT中IL-6、IL-1β、TNF-α、瘦素(Leptin)、脂联素(Adiponectin)的表达水平，并通过Masson染色以及IHC染色检测纤维化标志因子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)比较二者结肠组织纤维化程度; (2)构建伪无菌小鼠，qPCR检测小鼠粪便细菌表达水平验证伪无菌小鼠模型建立是否成功，分别收集5组CD患者与正常对照人群的粪便标本，分离提取粪便标本中的粪便微生物群移植到伪无菌小鼠的肠道中并设置对照，分别检测各组小鼠的体重以及全结肠长度变化、通过HE染色评估结肠组织病理学表现以及通过qPCR检测各组小鼠结肠组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎症因子的表达水平; (3)伪无菌小鼠移植CD患者以及正常对照人群的肠道菌群后，肠道通透性实验中使用ELISA检测各组小鼠血浆中异硫氰酸荧光素葡聚糖(FITC-dextran)及内毒素水平，使用 Western Blot与qPCR检测结肠组织中肠道屏障功能相关因子如封闭蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白(ZO-1)、电子钙粘蛋白(E-cadherin)、大麻素(CB1，CB2)的表达差异，并使用IF染色分析小鼠结肠组织中Occludin的表达;收集各组小鼠的血液样本，ELISA检测血液中IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1、瘦素、脂联素的水平，明确不同来源的肠道菌群移植后小鼠的血液中脂肪因子与炎症因子水平的差异; （4）收集上述进行肠道菌群移植后各组小鼠以及对照组小鼠的结肠组织和MAT，HE染色比较各组小鼠MAT的病理学改变，如脂肪组织结构、中性粒细胞聚集程度等，使用qPCR检测各组MAT中的TNF-α、IL-6、MCP-1、瘦素、脂联素表达水平的差异，并通过Masson染色比较各组小鼠结肠组织纤维化程度，Western Blot比较各组小鼠结肠组织中纤维化标志因子α-SMA和波形蛋白（Vimentin）的表达水平的差异; 结果: （1）CD病变结肠MAT的病理学表现与非病变结肠的MAT相比存在明显差异，病变结肠MAT的局部组织结构紊乱等情况更加严重，其IL-6、IL-1β、TNF-α、瘦素、脂联素的表达水平相较于非病变结肠MAT显著上调（p＜0.01）,且前者结肠组织纤维化程度更明显; （2）相比于使用正常人群肠道菌群移植的小鼠，使用CD患者肠道菌群移植的小鼠体重减轻更明显，全结肠长度明显缩短，结肠粘膜损伤Chiu分级显著升高，结肠组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎症因子表达明显上调（p＜0.01）; （3）经CD患者肠道菌群移植的小鼠肠道通透性明显增强、血浆内毒素水平明显上升（p＜0.01），肠道屏障功能相关因子Occludin及ZO-1、E-cadherin表达明显下调（p＜0.01）以及CB1、CB2表达明显上升（p＜0.01）; （4）经CD患者肠道菌群移植的小鼠血液中IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1、瘦素、脂联素明显上调（p＜0.01）; （5）相对于使用正常人群肠道菌群移植的小鼠，经CD患者肠道菌群移植后小鼠的病变MAT出现广泛的小静脉充血以及中性粒细胞的血管周围积聚等表现，在其病变肠道组织中纤维化标志因子α-SMA、Vimentin蛋白的表达显著上调（p＜0.01）。 结论: CD患者中存在肠道菌群失调与脂质代谢异常，且CD患者的肠道菌群在肠道屏障功能减弱时，可能诱发局部MAT脂质代谢异常，加重肠道炎症和肠上皮纤维化，进而诱导CD的发生发展。
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