摘要
目的： 肝母细胞瘤（hepatoblastoma,HB）是儿科常见的恶性肿瘤，其发病率逐年增加，起病较隐匿，临床上危害极大，治疗比较棘手，化疗是肝母细胞瘤治疗方式之一，但是目前适合儿童使用的化疗药物较少，同时晚期及转移性肝母细胞瘤治疗效果不佳，因此需要进一步寻求化疗药物或靶向药物治疗肝母细胞瘤；依维莫司是新一代雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂，最初用于器官移植后的免疫排斥反应，后研究发现其还具有抗肿瘤活性作用，已被批准用于治疗多种肿瘤，依维莫司同时也是一种有效的自噬激活剂，能够激活细胞自噬，诱导细胞凋亡，可作为一种有效的肿瘤抑制方式，目前依维莫司已在体内体外实验中验证具有抑制肿瘤增殖作用，然而，它在肿瘤抑制（特别是肝母细胞瘤）中发挥的作用在很大程度上仍未确定，可能是一种新的治疗肝母细胞瘤的思路。 本论文目标是以肝母细胞瘤细胞株（HepG-2、Huh-6）为研究对象，观察依维莫司对肝母细胞瘤细胞增殖、迁移、凋亡和自噬能力的影响，并初步探讨其作用机制，并建立肝母细胞瘤病人来源移植瘤(patient-derived xenograft，PDX)模型评价依维莫司的治疗效果，为依维莫司治疗肝母细胞瘤提供实验依据。 方法： 1、实验分组：将肝母细胞瘤细胞分为对照组、低、中、高浓度依维莫司处理组； 2、应用MTT比色法检测依维莫司对肝母细胞瘤细胞细胞活性的影响； 3、应用Transwell检测依维莫司对肝母细胞瘤细胞迁移能力的影响； 4、应用流式细胞术检测依维莫司对肝母细胞瘤细胞凋亡情况的影响； 5、利用 Western Blot方法检测肝母细胞瘤细胞增殖指标（细胞核抗原（PCNA））、凋亡指标（Bax、Bcl-2）、自噬指标（LC3B、ATG16L1）及蛋白EVA1A表达情况； 6、建立肝母细胞瘤PDX模型作为依维莫司药物评价平台，设置对照组、阳性对照组（顺铂组）、紫杉醇组与依维莫司治疗组，比较肝母细胞瘤的治疗效果； 7、统计方法：使用SPSS14.0统计分析软件对实验数据进行统计学数据分析，对实验数据的描述采用均数±标准误（X±SEM）形式。对于服从正态分布的采用单因素方差分析，不服从正态分布的使用非参数检验。 结果： 1、依维莫司对肝母细胞瘤细胞增殖与迁移的影响 （1）用依维莫司处理肝母细胞瘤细胞，肝母细胞瘤细胞的细胞活性受到不同程度的影响，与对照组相比较，差异有统计学意义； （2）与对照组相比，依维莫司处理后肝母细胞瘤细胞的PCNA表达水平随浓度升高而降低，差异有统计学意义； （3）与对照组相比，依维莫司对肝母细胞瘤细胞的迁移能力有抑制效应，且抑制效应随依维莫司浓度升高而上升，差异有统计学意义。 2、依维莫司对肝母细胞瘤细胞凋亡的影响 （1）与对照组相比，依维莫司处理肝母细胞瘤细胞后，细胞凋亡比例随依维莫司的浓度升高而上升，差异有统计学意义。 （2）与对照组相比，依维莫司处理肝母细胞瘤细胞后，Bax/Bcl-2表达水平随依维莫司的浓度升高而上升，差异有统计学意义； 3、依维莫司对肝母细胞瘤细胞自噬的影响 与对照组相比，不同浓度的依维莫司处理肝母细胞瘤细胞后，自噬相关蛋白LC3B和ATG16L1表达呈剂量依赖性上调，其中高浓度组对肝母细胞瘤细胞作用最明显，差异有统计学意义。 4、依维莫司对肝母细胞瘤细胞自噬机制相关蛋白EVA1A的影响 与对照组相比，不同浓度的依维莫司处理肝母细胞瘤细胞后，EVA1A蛋白的表达水平呈剂量依赖性上调，差异有统计学意义； 5、建立肝母细胞瘤PDX模型，依维莫司治疗组与传统化疗药物顺铂和紫杉醇相比，依维莫司组所测得的肿瘤体积均值均明显低于顺铂组和紫杉醇组，治疗效果最优，且组间计量资料差异具有统计学意义。 结论： （1）依维莫司可抑制肝母细胞瘤HepG-2和Huh-6细胞体外增殖与迁移的能力并促进凋亡的发生，证明依维莫司可诱导肝母细胞瘤细胞发生凋亡； （2）依维莫司可诱导肝母细胞瘤细胞自噬的发生，增加自噬相关蛋白的表达，EVA1A蛋白表达上调，推测依维莫司可通过调控EVA1A诱导肝母细胞瘤细胞发生自噬； （3）在肝母细胞瘤PDX模型上进行药效评价，发现依维莫司治疗肝母细胞瘤的效果优于传统化疗药物顺铂与紫杉醇，推测依维莫司可有望成为治疗肝母细胞瘤的潜在药物。 综上，在细胞实验中发现，依维莫司可抑制肝母细胞瘤细胞的增殖与迁移能力，促进自噬，诱导细胞凋亡，并在肝母细胞瘤PDX模型中验证依维莫司抑制肿瘤的效果优于传统化疗药物，可作为治疗肝母细胞瘤的新型药物。
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