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芥蓝BoaUGT74B1与BoaAOP2基因在芥子油苷生物合成中的功能解析
郑好1
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摘要
芥子油苷是主要存在于十字花科植物中的一种重要的植物次生代谢物质，在植物生长发育、防御反应和抗癌中发挥重要功能。二磷酸尿核苷葡萄糖基转移酶（thiohydroximate S-glucosyltransferase，UGT74B1）负责将硫代肟基酸糖基化生成脱硫芥子油苷。2-含氧戊二酸-双加氧酶（2-oxoglutarate-dependent dioxygenase，AOP2）负责将硫氧烷基芥子油苷转化为烯基类芥子油苷，例如催化 3-丁烯基芥子油苷（gluconapin，GNA）转化为萝卜硫苷（glucoraphanin，GRA）。芥蓝（Brassica oleracea var. alboglabra）富含芥子油苷，但具有抗癌活性的萝卜硫苷含量很低。本研究聚焦于解析 BoaUGT74B1 和 BoaAOP2 的功能，利用基因瞬时过表达技术过表达BoaUGT74B1基因，利用CRISPR/Cas9技术敲除BoaAOP2基因并获得高萝卜硫苷含量的芥蓝材料。主要的研究结果如下： 1. 克隆了芥蓝‘四季粗条’BoaUGT74B1 基因的单拷贝和 BoaAOP2 基因的三个拷贝。生物信息分析结果表明，BoaUGT74B1属于糖基转移酶超家族成员，与青花菜BolUGT74B1同源性最高；BoaAOP2属于2-氧化戊二酸双加氧酶超家族成员，与白菜BrAOP2同源性最高。亚细胞定位结果表明，BoaUGT74B1、BoaAOP2.1、BoaAOP2.2和BoaAOP2.3蛋白分别定位于芥蓝原生质体的叶绿体、细胞核、叶绿体和叶绿体中。 2. 芥蓝‘四季粗条’组织表达结果表明，在芥蓝成熟期的不同器官中，以幼果中的 BoaUGT74B1 表达量最高；在不同花器官中，以花蕾期的雌蕊中的 BoaUGT74B1表达量最高。BoaAOP2 基因 3 个拷贝的组织表达水平存在明显差异，总体上， BoaAOP2.1 基因的表达量高于 BoaAOP2.3，远高于 BoaAOP2.2。在不同时期和器官中，BoaAOP2.1 和 BoaAOP2.3 均在成熟叶中基因表达量最高；在不同花器官中， BoaAOP2.1 在盛花期的雌蕊中表达量最高，BoaAOP2.3 在花蕾期的萼片中表达量最高。BoaAOP2.2表达量在整个芥蓝植株中极弱，仅在子叶、幼果、花蕾期的萼片和盛花期的雌蕊中能够检测到较弱的表达。 3. 在芥蓝中建立了农杆菌介导的基因瞬时过表达技术，并利用该技术瞬时过量表达了BoaUGT74B1基因。BoaUGT74B1基因在芥蓝白花品种‘四季粗条’和黄花品种‘福州黄花’中被分别过量表达了 1.53 ~ 2.93 和 3.07 ~ 5.30 倍。两个品种的BoaUGT74B1 瞬时过表达植株叶片中总吲哚族芥子油苷含量分别是对应野生型的1.30 ~ 7.11 倍和 2.13 ~ 4.44 倍；四种吲哚族芥子油苷含量均增加，在‘四季粗条’芥蓝中以4-甲氧基-吲哚-3-甲基芥子油苷的含量增加最多，达到其野生型的12.14倍，在‘福州黄花’芥蓝中以吲哚-3-甲基芥子油苷的含量增加最多，达到其野生型的22.76倍。 4. 利用 CRISPR/Cas9 技术对 BoaAOP2 基因的 3 个拷贝进行了编辑，共获得了靶点1（Target 1）的 13 株和靶点 3（Target 3）的 14 株潮霉素抗性植株，测序表明靶点1的突变率为76.92%，靶点3的突变率为57.14%。靶点1的10个突变体中，包括5个aop2.1aop2.2aop2.3三突变体，2个aop2.1aop2.2双突变体，2个aop2.1aop2.3双突变体和1个aop2.1单突变体；靶点3的8个突变体中，包括3个aop2.1aop2.2双突变体和5个aop2.1单突变体。BoaAOP2.1和BoaAOP2.2基因为组合突变，包括大片段缺失、插入和替换，BoaAOP2.3基因仅为单碱基替换。对boaaop2突变体T1代遗传分析表明，CRISPR 编辑的突变能够传递给下一代并部分进行了重编辑。在boaaop2 突变体 T1 代中 GRA 含量是野生型的 11.71 ~ 41.29 倍（0.082 ~ 0.289 μmol·g-1 FW）)，且 GRA/GNA 比值增加，而总脂肪族芥子油苷和 GNA 含量减少。
关键词
芥蓝/芥子油苷/BoaUGT74B1基因/BoaAOP2基因/瞬时过表达/萝卜硫苷/生物合成/抗癌活性引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
蔬菜学导师
孙勃学位年度
2023学位授予单位
四川农业大学语种
中文中图分类号
R2