摘要
随着经济与社会的高速发展，世界各国联系不断加强，人类面临着公共卫生问题的挑战也日益增强。由于具有传播速度快，途径多，宿主广泛等特点，病毒、细菌、寄生虫等病原体一直是威胁着人类健康安全，例如流感病毒，肺炎球菌，血吸虫等。面对病原体的侵害，我们主要的预防方法和治疗措施是疫苗接种和抗体治疗。产生抗体的 B 细胞是疫苗接种的主要效应细胞，抗原特异性B细胞是机体对抗病原体感染关键的细胞。直接利用抗原特异性B细胞进行预防和治疗疾病是值得探索的研究。已有文献报道，抗原特异性 T 细胞来源的iPSCs可以分化为具有功能的抗原特异性T细胞，然后移植到病人体内进行疾病治疗。同为免疫效应细胞，我们提出将抗原特异性B细胞重编程为iPSCs，然后再分化成为抗体分泌细胞，最后再将抗体分泌细胞应用于疾病预防和治疗的研究思路，从而达到更加有效、精准的治疗效果，开发出新的疫苗和细胞治疗方案。 研究目的: 将抗原特异性B细胞直接重编程为iPSCs，然后再利用分化、转分化或者基因编辑等技术重启抗体基因的表达，获得抗体分泌细胞。 研究方法: 从免疫了H1N1（A/California/07/2009）疫苗的志愿者的外周血中分离PBMC，利用EBV永生化的方法培养扩增B细胞，利用有限稀释法和实验室已有的抗体筛选技术获得能够分泌抗H1N1流感病毒的抗体的特异性B细胞，再将七个重编程因子用电转染的方法导入抗原特异性B细胞，通过重编程使其成为iPSCs，然后通过qPCR、免疫荧光和体内形成畸胎瘤的方法对抗原特异性B细胞来源的iPSCs进行多能性鉴定。 研究结果: （1）通过有限稀释法得到了LC206-EBV-B和Y104-EBV-B两株永生化的抗原特异性B细胞单克隆, 筛选到的这两株细胞均可以分泌中和H1N1的抗体。 （2）将携带有7个重编程因子的episomal质粒电转入永生化的抗原特异性B细胞中，将其重编程为iPSCs，并且利用qRT-PCR，免疫荧光以及体内畸胎瘤形成实验等验证了iPSCs的多能性。 （3）对于重编程得到的iPSCs，在蛋白水平以及RNA水平检测不到抗体基因的表达，但抗体基因序列仍然保留在 iPSCs 的基因组中，且抗体基因的序列没有发生突变，与重编程之前的抗体序列一致。 （4）EBV相关基因在Y104-iPSC-C3和 LC206-iPSC-C4的早代数的 iPSC克隆中可以检测到，在所检测的其他克隆的不同代数的iPSCs中均检测不到。 研究结论: （1）利用 EBV 永生化的方法获得了分泌抗 H1N1 流感病毒抗体的抗原特异性B细胞； （2）永生化的抗原特异性B细胞可以被重编程为iPSCs，且抗原特异性B细胞来源的iPSCs具有与hESCs相似的多能性， （3）抗原特异性B细胞来源的 iPSCs 的基因组中仍然存在有重编程之前的抗体基因，但iPSCs关闭了抗体基因的表达。 （4）随着抗原特异性B细胞来源的iPSCs的传代次数的增多，其细胞中不再携带EBV相关基因。 我们的实验结果为后续的将 iPSCs 分化成为抗体分泌细胞用于疾病的预防和治疗奠定了基础。
NETL