摘要
背景: 视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)对维持视觉系统功能至关重要。RPE细胞损伤或功能障碍会导致退行性视网膜病变，例如，年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)，其中萎缩性(干性)AMD被认为是RPE功能障碍和细胞进行性丢失的结果。然而，目前临床上还没有针对萎缩性AMD的有效治疗方法。一个潜在的治疗策略是刺激内源性RPE再生，使损伤的组织可以内源性修复。为了实现这一可能性，需要更深入地理解RPE再生过程的机制。在哺乳动物中，RPE的再生能力极其有限，相比之下，斑马鱼具有再生不同类型组织的能力，包括RPE，但目前对RPE再生过程的分子机制知之甚少。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of Rapamycin,mTOR)是细胞生长和增殖的重要调节因子，并与器官及组织再生相关。然而，mTOR信号通路在RPE再生过程中的作用尚未报道。 目的: 本研究旨在探讨mTOR在斑马鱼RPE损伤后再生过程的作用及其分子机制，为研究哺乳动物系统RPE再生提供基础，以期为AMD等以RPE原发性损伤为特征的退行性眼病的治疗提供诊疗新思路。 方法: 1.利用rpe65a:nfsB-eGFP转基因斑马鱼和甲硝唑(metronidazole,MTZ)介导的RPE基因消融系统诱导RPE损伤及随后的再生反应。在RPE损伤后再生过程不同时间点通过免疫荧光染色技术靶向磷酸化的40S核糖体蛋白S6(p-S6),来评估mTOR信号在RPE损伤后的空间和时间活性。 2.利用靶向mTOR的两种不同抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)和INK128、mTOR的激动剂MHY1485以及溶剂对照二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)分别处理 rpe65a:nfsB-eGFP 转基因幼鱼，通过定量分析RPE层的细胞增殖(BrdU 24小时渗入实验)及RPE(色素或者eGFP)恢复情况综合评估RPE再生情况;利用斑马鱼mtor等位基因突变体(mtorsa16755)与rpe65a:nfsB-eGFP转基因斑马鱼进行杂交，并对其后代进行基因型分型，鉴定出mtor-/-;rpe65a:nfsB-eGFP基因型用于后续实验。通过比较mtor-/-;rpe65a:nfsB-eGFP与野生型幼鱼RPE层细胞增殖和色素恢复情况，分析从基因层面上抑制mTOR活性是否影响RPE再生。 3.利用荧光流式细胞分选技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)分别对 MTZ 诱导 RPE 损伤后 2 和 4 天(days post injury,dpi),对应未损伤组受精后7和9天(days post fertilization,dpf)的DMSO以及Rapamycin处理的rpe65a:nfsB-eGFP幼鱼眼组织的单细胞悬液进行分选，并对分选后的eGFP+RPE细胞进行高通量全转录组RNA测序(RNA-sequencing,RNA-seq)。通过比较 MTZ+DMSO 和 Rapamycin处理组的表达谱，以MTZ+DMSO为对照组，确定当mTOR活性被抑制时，RPE损伤后再生过程中的RPE细胞显著差异表达的基因。 4.利用巨噬细胞/小胶质细胞带有mCherry荧光标记基因的转基因斑马鱼 mpeg1:mCherry;rpe65a:nfsB-eGFP。使用 Rapamycin 或 DMSO处理mCherry+eGFP+转基因幼鱼，并通过mCherry免疫荧光染色以评估mTOR活性受抑制后巨噬细胞/小胶质细胞对RPE损伤的反应性;利用 PLX3397 或 DMSO 处理 mpeg1:mCherry;rpe65a:nfsB-eGFP 转基因幼鱼以清除组织中的巨噬细胞/小胶质细胞，并通过p-S6免疫荧光染色分析巨噬细胞/小胶质细胞对RPE细胞中mTOR信号的调控作用。 5.统计学方法:对于每个数据集，进行D''Agostino-Pearson混合正态性检验，以确定数据是否服从正态(高斯)分布。对于服从正态分布的数据，两组间比较采用Welch校正的非配对t检验，否则采用非参数Mann-Whitney检验。对于三组间多重比较的分析，采用Kruskal-Wallis ANOVA和Dunn''s多重比较检验来确定方差和显著性。P值＞0.05被认为不显著(ns,not significant),显著性P值如下:*＜0.05,**＜0.01,***＜0.001,****＜0.0001。 结果: 1.RPE损伤后，斑马鱼幼鱼眼组织RPE层p-S6水平从6 hpi到3 dpi显著升高，在6-12 hpi达到峰值并持续到3 dpi。 2.RPE损伤条件下，4 dpi时，与DMSO对照组相比，Rapamycin和INK128处理显著抑制了损伤后RPE层的细胞增殖(p=0.0006)以及色素恢复（p＜0.0001）;3 dpi时，与DMSO对照组相比，MHY1485处理显著促进了 RPE层的细胞增殖（p＜0.0001）以及ZPR2的恢复（p=0.0058）;与mtor+/+对照相比，mtor-/-幼鱼RPE层增殖细胞数量显著减少（p=0.0105）,eGFP的恢复显著降低（p=0.0083）。 3.RNA-seq分析结果表明通过Rapamycin抑制RPE再生过程中mTOR活性，2dpi时，RPE细胞内免疫相关基因表达显著下调;4dpi时，RPE细胞内小分子运输以及细胞间交流相关基因显著下调。 4.与MTZ+DMSO对照组相比，Rapamycin处理的幼鱼RPE层中巨噬细胞/小胶质细胞的浸润显著减少（p＜0.0001）;PLX3397处理显著抑制了幼鱼RPE层中p-S6水平（p=0.0001）。 结论: 1.RPE损伤后，RPE细胞中mTOR信号通路被激活。 2.药物（Rapamycin/INK128）和基因（mtor）抑制 mTOR 信号通路损害了 RPE的再生，而药物（MHY1485）激活mTOR信号通路促进了损伤后RPE的恢复，表明mTOR活性对RPE再生至关重要。 3.RNA-seq鉴定了许多在RPE再生早期和晚期依赖于mTOR活性的基因和通路，其中包括免疫系统相关通路、小分子运输以及细胞间交流相关通路，表明mTOR在再生早期作为免疫反应的调控因子起作用，而随后，mTOR依赖的基因调控可能通过促进RPE细胞的功能恢复以促进RPE再生。 4.mTOR信号通路的激活对RPE损伤后巨噬细胞/小胶质细胞募集到损伤部位是必需的，且募集的巨噬细胞/小胶质细胞在RPE再生反应后期以非炎症依赖方式维持RPE细胞中mTOR的活性。
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