摘要
性别是两性生殖行为的基础，在物种的生存和繁殖中发挥举足轻重的作用。在硬骨鱼类中，存在多种性别决定系统，从遗传因素到环境因素。日本青鳉（Oryzias latipes）的性别决定机制是一个复杂的遗传和环境因素相互作用的过程。正是这种多方面的性别决定系统使其成为研究影响脊椎动物性别决定的遗传和环境因素的有趣和有价值的模式生物体。 Dmrt1 基因是一种高度保守的基因，在各种脊椎动物的性别决定与分化过程发挥关键作用。本研究以发育生物学重要的模式生物体日本青鳉为主要的研究对象，构建了 dmrt1突变体与表达外源dmrt1基因的转基因青鳉，通过对突变体和转基因鱼性反转表型的研究，分析dmrt1基因对青鳉性别决定的影响。 主要研究结果如下： 1. 利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，靶向敲除日本青鳉dmrt1基因，在F3代中成功获得了纯合突变体。结合突变体的外观特征和对突变体遗传性别的鉴定，发现XY突变体都表现出雌性外观特征，这意味着XY纯合突变体发生了性反转。对突变体进一步的性腺解剖和组织切片发现，XY突变体的性腺组织为发育不完全的卵巢。利用荧光定量PCR检验XY突变体青鳉的卵巢中性别相关基因的变化，与对照组野生型XY青鳉相比，突变体青鳉雄性性别相关基因dmrt1、tex9、myb、protamin表达水平显著下调，雌性性别相关基因cyp19a、foxl2、bouncer.2、42sp50、nanos3表达水平显著上调。同时，XX dmrt1-/-雌性发育相关基因的表达水平发生改变，进而诱发了XX dmrt1-/-卵巢发育异常。 2. 克隆鉴定了中华青鳉（Oryzias sinensis）的dmrt1基因，通过蛋白序列同源性分析与进化分析，发现中华青鳉与日本青鳉的dmrt1高度同源，进化关系接近。本研究进一步构建了中华青鳉 dmrt1 基因的真核表达载体 pTol2-CMV-Osdmrt1-3×HA，并通过显微注射技术注射到日本青鳉受精卵中。通过PCR鉴定确定了中华青鳉dmrt1基因成功整合到了日本青鳉的基因组中，Western blot检测HA标签在蛋白水平验证了外源dmrt1基因在青鳉体内的表达，表明转基因青鳉构建成功。对转基因青鳉的表型分析发现XX转基因青鳉外观表现为雄性青鳉的特征，性腺解剖及组织切片结果显示XX转基因青鳉出现正常发育的精巢。将XX转基因雄鱼与野生型XX雌鱼配对，雌鱼正常产卵且繁殖力和受精率与对照组无明显差异。荧光定量PCR结果显示XX转基因青鳉精巢中dmrt1、dcr1、tex9、myb、protamin雄性发育相关基因表达水平显著上调，雌性发育相关基因cyp19a、foxl2、42sp50、nanos3表达水平显著下调。 综上所述，本研究分析了dmrt1基因在青鳉性别决定级联中发挥的重要作用，在促进和维持青鳉的雄性发育的同时也抑制雌性发育，是参与青鳉性别决定的关键基因，其表达剂量的增高可以促进雌性青鳉逆转为雄性。青鳉dmrt1突变使XY雄鱼性反转为雌鱼特征，而且XX突变体雌鱼卵巢发育异常。这些发现为水产养殖经济鱼类的单性培育和基因编辑育种提供科学的理论依据和参考资料。
NETL