摘要
目的: X连锁视网膜劈裂症（X-linked retinoschisis，XLRS）是一种X连锁隐性遗传视网膜疾病，以双侧视网膜受累多见。XLRS患者典型的临床表现包括视力明显下降，眼底可见黄斑区辐状皱襞，OCT显示视网膜内层劈裂，以及ERG表现为负波型。但不同XLRS患者在视网膜结构和功能改变上存在广泛的异质性，为临床诊疗带来了挑战，目前为止仍未能建立明确的基因型-表型相关性。此外，目前XLRS临床治疗仍以随访观察、碳酸酐酶抑制剂等药物及并发症的治疗为主，缺少有效的预防和治疗方法。已开展的基因治疗临床试验中的炎症反应成为不容忽视的安全风险。因此，本研究旨在:1）分析XLRS患者的临床特征和分子诊断，探索SD-OCT三维指标，将其应用在基因型-表型相关性分析的研究中;2）利用RS1分子动力学模拟分析为基因型-表型相关性的研究找到新的突破口;3）为了进一步探索XLRS的囊腔分割，拟设计一个基于深度学习的XLRS患者OCT图像囊腔自动分割系统，并结合深度强化学习优化的数据增强策略提高其性能;4）拟构建XLRS患者特异性小鼠模型及患者来源的iPSC来深入了解XLRS的致病机制，并基于动物模型探索基因治疗，研发新型安全高效的病毒/非病毒载体。 方法: 1.纳入临床诊断XLRS且经过基因检测确定携带RS1基因变异的37例患者。对患者行全面的眼科检查，包括视力，裂隙灯检查，散瞳后间接检眼镜查眼底，彩色眼底照相，眼底自发荧光照相，SD-OCT和ERG。其中评SD-OCT测量指标包括:中心凹厚度（CFT）、囊腔体积（CCV）和光感受器外段长度（PROS）。CCV定义为患者25张水平多线扫SD-OCT扫描图像中囊腔面积的总和，乘以OCT扫描的间隔距离，并由自主研发的OCT囊腔体积自动计算系统（OCT-CCSEG）实现自动化测量。同时，对所有错义变异进行分子动力学模拟（MD）,以获得有关变异所致的RS1蛋白结构改变指标，如RMSD、SASA、表面疏水区域以及二级结构中β链的百分比的改变，分析变异对蛋白质结构的影响，总结基因型表征。分析基因型与表型之间的关联。 2.纳入临床诊断XLRS且经过基因检测确定携带RS1基因变异的30例患者，所有患者均已行双眼OCT成像。数据集的囊腔标注在蔡司APEER平台进行，由两位具有五年以上经验的眼科医生人工标注完成。采用五种最先进的DL模型-U-Net、U-Net++、Attention U-Net、Residual U-Net和TransUNet-在30名XLRS患者的1,500张OCT图像数据集上进行分割任务，并结合深度强化学习(RL)优化的数据增强来提高模型的性能。 3.构建Rs1R213W点变异模型鼠并对其表型完成鉴定，包括鼠尾测序、眼底彩照、OCT、ERG,蛋白表达，qPCR,视网膜HE染色及免疫荧光染色。采用OCT及ERG评估小鼠自然病程，其中小鼠劈裂囊腔的量化采用自主研发的针对小鼠CCV自动化测量平台Deep-OCT-MCCSEG计算完成。利用小鼠视网膜RNA转录组测序探索该病的分子机制，并采用细胞因子检测，蛋白定量及免疫荧光进行后续验证。利用Cytotune-iPS2.0Sendai Reprogramming试剂盒法及ReproRNATM-OKSGM Kit试剂盒法构建两例XLRS患者来源的iPSCs。 4.合成非病毒载体CS-Gua,在前期构建的Rs1R213W模型鼠及ARPE-19和661W细胞中分别进行体内及体外的转染效率及安全性的验证，探索非病毒载体应用于XLRS基因治疗的可行性。同时，研发构建新型AAV，完成体内体外转染效率及安全性的评估后利用新型AAV载体注射模型鼠玻璃体腔行基因治疗，给药完成行OCT及ERG评估以分析重组病毒对视网膜结构和功能的改善。免疫荧光染色评估治疗后基因表达及免疫炎症水平。 结果: 1.本研究确定了27种不同的RS1变异，其中包括一个新发变异c.336_337insT(p.L113Sfs*8)。XLRS队列患者平均发病年龄为14.76±15.75岁，平均视力为0.84±0.43logMAR。平均CCV为1.69±1.87mm3，CCV与CFT显著相关(R=0.66,p＜0.01)。在错义变异的基因型-表型相关性分析中，CCV与变异所致RS1蛋白结构改变指标显著相关，这些指标包括均方根偏差(R=0.34，p=0.04)、溶剂可及表面积(R=0.38,p=0.02)和表面疏水区域(R=0.37，p=0.03)。此外，暗反应3.0ERG a波和b波的振幅与β-螺旋在二级结构中的百分比变化显著相关(R=-0.58,p＜0.01;R=-0.53,p＜0.01)。 2.RL优化的数据增强策略提高了数据的多样性和模型的泛化能力，使得深度学习模型在分割囊腔方面达到了人工标注的准确性水平。U-Net++的性能超过了其他模型，达到了0.9927的准确率和0.8568的Dice系数。 3.本研究构建了Rs1R213W模型鼠，该模型在视网膜结构和功能改变两方面均能很好地模拟人类疾病表型。其中，在小鼠劈裂囊腔的观察及量化中，设计了小鼠视网膜囊腔体积CCV的计算方法，并自主研发了针对小鼠CCV的自动化计算平台Deep-OCT-MCCSEG。此外，自然病程的观察显示模型鼠在出生后12-14天出现劈裂，之后囊腔逐渐增大，8周龄时达到最大，之后随着年龄的增加又逐渐萎缩。而模型鼠的ONL厚度从2周龄开始观察后就一直呈现下降的趋势，提示了感光细胞的数量随年龄有所进展。同时，对模型鼠的ERG评估也证明了其视网膜功能随着年龄的增加而下降。我们发现Rs1R213W模型鼠RS1基因表达较野生型小鼠重度下降，且存在突触功能障碍。免疫荧光显示模型鼠中的OPL受到了破坏，一些PSD95和mGluR6被误定位到了外核层(ONL)。同时，转录组测序及细胞炎症因子检测提示模型鼠存在微胶质细胞的活化及其相关的炎症级联反应。除了动物模型外，本研究还完成了两例XLRS患者来源的RS1iPSCs的建系及鉴定。 4.从细胞转染以及毒性实中验筛选出了最佳的接枝比的非病毒载体CS-Gua,进行动物实验。在体外转导效率与安全性评估的实验中，即使CS-Gua显示出良好的穿透性，荧光切片中可以观察到药物能够实现穿透视网膜在感光细胞层表达，但其在眼底照相中展现出一定的视网膜毒性。注射后小鼠眼底呈现白色斑片状病灶及血管白线。在评估新型AAV病毒基因治疗后小鼠视网膜结构，功能，以及RS1蛋白表达的实验中，我们发现重组病毒经玻璃体腔注射Rs1R213W小鼠模型后，能够有效抑制视网膜囊腔劈裂并有助于保护视杆和视锥细胞的数量。同时，在视网膜功能方面可以提高感光细胞和双极细胞电信号水平，从而达到治疗的目的。此外，重组病毒成功地使得模型鼠表达了RS1蛋白，且外源性Rs1基因表达可以对模型鼠视网膜中的小胶质细胞活化有轻微抑制作用。 结论: 1.CCV是量化XLRS视网膜囊腔结构改变的有效的指标。本研究自主研发的OCT-CCSEG软件可自动化识别囊腔并计算CCV,并可应用于评估病程进展及个性化治疗。此外，利用RS1分子动力学模拟分析为基因型-表型相关性的研究提供了新视角，变异所致的RS1蛋白质结构改变与评估XLRS严重程度的CCV和ERG临床指标相关联。 2.结合基于强化学习的自动数据增强，深度学习分割模型为自动分割OCT图像中的囊腔提供了一种稳定且精确的方法。为进一步利用OCT进行XLRS精确化临床评估及基因治疗疗效评估的检测奠定了基础。 3.本研究构建了Rs1R213W模型鼠及两例XLRS患者来源的RS1iPSCs,并完成了模型鼠及iPSC的鉴定。同时，探索了模型鼠的自然病程，记录了其视网膜结构和功能随时间的改变，为后续基因治疗提供了完善的研究基础。此外，我们发现模型鼠存在突触功能障碍且存在微胶质细胞的活化及其相关的炎症级联反应。提示应在早期就干预抑制微胶质细胞的活化及其相关的炎症级联反应。 4.CS-Gua在体内实验中虽然具有一定程度的穿透性和转导效率但是其所展现的视网膜毒性时非常显著的。这一缺陷限制了其在作为XLRS基因治疗载体方面的应用前景。而新型AAV载体在体内体外实验均显示出良好的转导效率及安全性。在模型鼠的基因治疗实验中，重组病毒可以改善视网膜的结构及功能从而达到治疗的目的，并对视网膜中的小胶质细胞活化有轻微抑制作用。 创新点: 1.本研究探索了SD-OCT中量化囊腔的三维指标并发现CCV是量化XLRS视网膜囊腔结构改变的有效指标。采用自主研发的OCT-CCSEG软件自动化识别囊腔并计算CCV,实现精准高效测量。 2.本研究首次从SD-OCT的三维指标和分子动力学模拟的角度探索了XLRS的表型与基因型的相关性。 3.首次将深度学习应用于XLRS的患者及模型鼠OCT图像的囊腔分割识别中，为疾病监测和制定个性化治疗策略提供了一个可靠的工具。 4.构建了Rs1R213W模型鼠及两例XLRS患者来源的RS1iPSCs并完成了鉴定。在自然病程的观察中，首次记录了Rs1模型鼠视网膜囊腔体积随时间的变化。此外，提出应在早期就干预抑制XLRS微胶质细胞的活化及其相关的炎症级联反应。 5.探索了新型非病毒载体CS-Gua在XLRS基因治疗应用中的可行性。同时，创新性地构建了新型AAV病毒载体并完成了其在模型鼠基因治疗中的探索。
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