摘要
雪上一枝蒿为云南特色的林源药用植物资源，为短柄乌头Aconitum brachypodum Diels.的干燥块根，具有祛风除湿、散瘀疗伤、活血止痛的功效，是民族药产业发展中一个很具特色的植物资源。雪上一枝蒿的商品药材习用品较多，富含乌头碱等有毒二萜生物碱，为毒性药材，目前对雪上一枝蒿的炮制工艺、炮制减毒机制以及新的药效活性研究较少，有必要在理清基源的基础上开展炮制工艺、炮制减毒机制和药理活性研究。本论文基于脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid， DNA）条形码和叶绿体基因组技术，探讨雪上一枝蒿与其他近缘种间的亲缘关系；采用高效液相色谱、液质联用等多种精密分析手段，对比生物碱以及无机元素的含量，科学、系统的筛选炮制工艺，同时通过急毒、抗炎、镇痛、护肝的药效对比评价炮制工艺减毒的效果；利用非靶向代谢组学分析炮制前后的化学成分差异，运用中药模拟炮制进行对照品单体的模拟水解，阐明主要C19型生物碱成分在炮制过程中水解或分解可能的路径；对化学成分进行分离鉴定，采用网络药理技术、分子对接预测化合物细胞毒活性的靶点、通路，探讨炮制后雪上一枝蒿化合物细胞毒活性可能的作用机制，为雪上一枝蒿资源及其应用新领域的开发提供理论依据和技术支撑。主要的研究结果如下： （1）DNA条形码分子鉴定研究结果发现ITS2对雪上一枝蒿和近缘种有一定的鉴别能力，所采集的昆明市东川区、丽江市玉龙县栽培的雪上一枝蒿和已报道的短柄乌头A. brachypodum高度近缘，迪庆州香格里拉市栽培的雪上一枝蒿与多裂乌头A. polyschistum高度近缘；利用Illumina序列，建立了不同产地雪上一枝蒿栽培品的完整叶绿体基因组序列，基于30个植物的叶绿体基因组建立了ML系统发育树，结果表明短柄乌头系亲缘关系比较近；运用液相色谱建立了指纹图谱，表明不同产地雪上一枝蒿栽培品和野生资源化学成分相似度较高。 （2）设计甘草、生姜、黑豆、诃子等不同辅料，酸、碱、蒸制等不同炮制方法，以双酯型、单酯型、胺醇型生物碱和无机元素含量作为指标，科学、系统的评价炮制方法，经过筛选，雪上一枝蒿药材经蒸制后，有毒的双酯生物碱含量最低、无毒且有药效的单酯生物碱含量最高，Pb、Th、Cr、Al以及Sb等有害元素的含量显著降低；以二萜类生物碱、雪上一枝蒿甲素、总生物碱、粗多糖的含量为指标，比较蒸制、煮制、高温高压炮制6种不同干燥温度上述指标的含量变化，结果表明，经蒸制后130℃干燥，双酯降低率、单酯增加率、总生物碱的含量均最高，为最佳的炮制工艺。 （3）利用动物模型，通过急毒、抗炎、镇痛、护肝的药效对比评价炮制工艺减毒效果。研究发现，经过炮制，小鼠灌胃给药急性毒性实验的最大给药量为30.0 g/kg，比炮制前药材毒性大大降低（炮制前药材的半数致死量LD50为1.37 g/kg）；通过比较肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素6（interleukin-6，IL-6）的含量，炮制后雪上一枝蒿不同提取物均有一定的体外抗炎作用；巴豆油致小鼠耳肿实验，醋酸致小鼠疼痛性扭体实验结果表明，炮制后雪上一枝蒿的生物碱组分经外用给药，具有一定的抗炎和镇痛活性；雪上一枝蒿经过炮制，其粗多糖组分对化学性（乙醇）肝损伤的保护效果有一定的提升。 （4）利用非靶向代谢组学分析炮制前后雪上一枝蒿中化学成分差异，主要有42个差异成分，炮制后毒性高的双酯型生物碱含量显著降低，毒性较低的单酯型生物碱以及乌头原碱含量显著升高，为可能的减毒原理。运用中药模拟炮制方法对11个单体对照品进行模拟炮制，初步推断，双酯型生物碱的降解主要有二条路径，第一条是脱C8、C14位乙酰基的水解反应；第二条是C8位乙酰基、C15位羟基脱乙酸得相应的焦乌头碱，再水解脱去C14位苯乙酰基得相应的焦乌头原碱。 （5）对炮制后雪上一枝蒿进行了化学成分的分离，鉴定得宋果灵、雪上一枝蒿乙素、雪上一枝蒿丙素、dihydroatisine、雪上一枝蒿甲素、麦芽酚、15-乙酰宋果灵、15-乙酰宋果胺、宋果灵、aldohypaconitine 10个化合物，其中化合物dihydroatisine、麦芽酚、15-乙酰宋果胺、aldohypaconitine是首次从该植物中分离得到。通过网络药理学和分子对接预测到AKT1、MAPK3、EGFR、MTOR、JUN以及HSP90AA1为可能的发挥肿瘤细胞调控作用的靶点基因，结合MTT实验验证推断雪上一枝蒿中生物碱成分可能通过调节PI3K-Akt和MAPK信号通路，从而抑制肿瘤细胞生长，促进细胞凋亡。
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