摘要
目的：皮肤老化是人体自然状态下不可避免的过程，分为生理状态下的内在老化和外部环境损伤下的外部老化。紫外辐射是致皮肤老化最严重的外部刺激因素，皮肤暴露在紫外线辐射下会引发光老化。前期体外筛选结果表明，三尖杉丙酮提取物对弹性蛋白酶有较好的抑制活性。因此拟开展对提取工艺相对简单、活性成分较为集中的三尖杉提取物进行抗光老化研究，找到其中的活性成分，并开展初步作用机制探究，为进一步深入研究提供实验依据。 方法：1、通过弹性蛋白酶抑制、自由基清除、对 Ultraviolet B（UVB）诱导的 HaCaT 细胞和小鼠皮肤损伤的保护作用，明确三尖杉丙酮提取物的抗光老化作用。2、通过乙酸乙酯萃取、酸提碱沉法优化提取工艺富集三尖杉五种提取物即三尖杉总提取物（Total extract，TE）、乙酸乙酯提取物（Ethyl acetate extract， EE）、水提取物（Aqueous extract，AqE）、非碱提取物（Non alkali extract，NE）、丙酮提取物（Acetone extract，AcE），分别检测弹性蛋白酶、自由基清除、β-半乳糖苷酶、细胞内活性氧(Reactive oxygen species ，ROS)水平变化，以及对 UVB诱导的 HaCaT 细胞和小鼠皮肤光老化模型的保护作用，优选出光老化保护作用较好的三尖杉提取物。3、借助LC-MS二级质谱分析，对弹性蛋白酶抑制率、自由基DPPH清除率、细胞存活率进行PCA主成分分析，找到其主要作用的活性化合物。4、通过网络药理学和分子对接预测活性化合物的信号通路和靶点，进一步采用 Western blot 技术验证活性化合物对预测信号通路和靶蛋白的调节作用。 结果：1、三尖杉丙酮提取物 AcE 在 10 μg/mL 浓度下可明显抑制弹性蛋白酶、清除自由基生成、保护UVB诱导的HaCaT细胞即小鼠皮肤损伤。2、优化提取工艺后富集得到TE、EE、AqE、NE、AcE在抑制弹性蛋白酶、清除自由基、保护UVB诱导的HaCaT细胞损伤、抑制细胞衰老β-半乳糖苷酶上均表现出活性。3、LC-MS二级质谱分析出三尖杉提取物中有75种化合物；PCA主成分分析靶向的活性化合物为槲皮素（quercetin）、槲皮素-3-O-芸香糖苷（quercetin-3-O-rutinoside）。4、网络药理预测结果表明，quercetin、quercetin-3-O-rutinoside通过调控43个共同靶点和120条通路对皮肤光老化产生作用。通过胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、外消旋-α 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、基质金属蛋白酶-1 （ MMP-1 ）等关键靶蛋白介导磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路发挥抗皮肤光老化作用。分子对接表明筛选的靶点蛋白与有效化合物具有-4.19、-3.33、-5.3、-2.05 的较低结合能。Western blot 结果表明 EE、AqE及活性成分quercetin、quercetin-3-O-rutinoside均可下调PI3K/AKT信号通路的PI3K、AKT1和MMP-1蛋白表达。 结论：三尖杉乙酸乙酯层和水层提取物具有抗光老化作用，潜在的有效活性成分是黄酮类化合物quercetin、quercetin-3-O-rutinoside，其抗皮肤光老化具有多成分、多靶点、多途径的作用特点。主要通过下调PI3K/AKT信号通路的PI3K、AKT1和MMP-1蛋白水平，发挥体内外抗皮肤光老化作用，这为三尖杉提取物在抗皮肤光老化药品和化妆品方面的应用提供了理论依据。
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