摘要
大食物观背景下，“无抗”养殖大力发展，益生菌做为抗生素替代品在水产养殖领域取得了瞩目的成就，广泛用于治疗和预防水产动物各种疾病。如何进一步提高益生菌在绿色水产养殖应用中的使用效果是目前产业中迫切需要解决的重要科学问题。宿主来源的益生菌因具有适应宿主环境的优势，较非宿主源益生菌可以发挥更好的益生效果。此外，益生菌必须经过多个生物屏障才能到达效应位点，满足一定数量的活菌是其发挥益生作用的关键因素。因此，本研究旨在从黄河鲤肠道中分离获得一株具有抗菌活性的潜在益生菌，并探究益生元葡萄糖酸钠对该菌株的促生长影响。通过养殖试验，检验二者在饲料中联合添加饲喂对鲤生长性能、肠道健康、抗感染能力的效果是否优于单独添加时的效果。主要研究内容及结果如下： （1）鱼源益生菌的分离： 本研究从黄河鲤肠道中共分离出21株细菌，其中菌株R-71003产酶活性较高，同时产蛋白酶、甘露聚糖酶、淀粉酶和纤维素酶，是一株潜在的益生菌。菌株R-71003 16S rRNA序列与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）具有99.85%的同源性；基因组序列总长为4,221,564 bp，GC含量为46.12%，含有4403个编码序列（CDS），内含1个质粒；ANI分析和dDDH分析结果显示，菌株R-71003与贝莱斯芽孢杆菌相似度最高，分别为97.31%和84.50%。综上，菌株R-71003是一株新的贝莱斯芽孢杆菌。抑菌试验表明菌株R-71003可抑制维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、嗜水气单胞菌（A. hydrophila）等鱼类常见病原菌生长；药敏试验显示菌株 R-71003对氨苄西林、庆大霉素、青霉素等常见抗生素敏感；安全性试验显示菌株R-71003无溶血性，不造成鲤致病致死，是一株安全的菌株。非生物胁迫试验表明菌株R-71003在低pH（2）、高胆汁盐浓度（0.3%）和高温（80和90℃）表现出较高的存活率，具有耐受性。此外，该菌在24 h自聚集能力为83.5%，与乙酸乙酯和氯仿的疏水性远高于二甲苯，具有较好的自聚集能力和细胞表面疏水性。综上，B. velezensis R-71003表现出良好的益生潜力。 （2）葡萄糖酸钠对B. velezensis R-71003的促生长作用： 为促进B. velezensis R-71003的应用效果，提高该菌株在肠道中的数量，本研究以不同浓度的葡萄糖酸钠添加对B. velezensis R-71003进行纯培养，探讨葡萄糖酸钠在体外和体内对B. velezensis R-71003生长的影响。结果表明，葡萄糖酸钠浓度在0.3-0.9%时能促进B. velezensis R-71003的生长（P＜0.05），显著提高菌株生长相关基因dnaA和yabD的表达水平（P＜0.05），而浓度在1.5-2.4%时抑制该菌株的生长。同时，葡萄糖酸钠浓度为0.6%时，显著提高B. velezensis R-71003在低pH（2）和高温（90℃）环境下的存活率（P＜0.05），抗逆性增强。体内环境下，0.6%的葡萄糖酸钠显著增加肠道内贝莱斯芽孢杆菌的数量（P＜0.05）。上述结果表明，葡萄糖酸钠在体外和体内均促进B. velezensis R-71003的生长。 （3）B. velezensis R-71003联合葡萄糖酸钠对鲤肠道健康的作用： 基于葡萄糖酸钠具有提高B. velezensis R-71003在肠道中数量的效果，可能促进B. velezensis R-71003作为饲料添加剂的应用效果。因此，深入研究二者联合进行饲料添加应用的效果是否优于单独使用时的效果。选取360尾健康鲤（10.5±1.5 g）平均分成四个组，每组3个重复，对照组（CK）日粮为商业饲料，葡萄糖酸钠组（SG）、B. velezensis R-71003组（BV）和B. velezensis R-71003联合葡萄糖酸钠组（BVSG）日粮中分别单独或联合添加葡萄糖酸钠（6 g/kg）与B. velezensis R-71003（1×108 CFU/g），饲喂10周，评估鲤的生长性能、肠道健康以及肠道微生物群落变化。结果显示，饲喂单独添加葡萄糖酸钠的饲料显著提高鲤肠道的claudin-2基因的表达水平，提高消化酶（蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶）、AKP、ACP、SOD和GSH-px的活性并降低MDA含量。饲喂单独添加B. velezensis R-71003的饲料显著增强鲤的生长性能（增重率、末体长和特定生长率），提高肠道claudin-2和ZO-1基因的表达水平，提高肠道的蛋白酶、α-淀粉酶、AKP、ACP、SOD和GSH-px活性，提高抗炎细胞因子TGF-β的水平，降低鲤的饲料转化率和肠道中MDA、促炎细胞因子TNF-α含量。此外，B. velezensis R-71003组对肠道内乳杆菌属、乳球菌属、栖粪杆菌属、拟杆菌属和梭菌属水平有显著提高作用，且厚壁菌门/拟杆菌门的比例降低。与SG组或BV组相比，饲喂联合添加B. velezensis R-71003和葡萄糖酸钠的饲料对鲤生长性能的提高、肠道屏障的稳定、消化能力的提高、免疫能力以及抗氧化能力的提高和对益生菌水平的提高更为显著。以上研究表明， B. velezensis R-71003与葡萄糖酸钠组合在应用中的效果优于二者单独使用的效果，推测这与葡萄糖酸钠对B. velezensis R-71003生长及数量的促进作用有关。 （4）B. velezensis R-71003联合葡萄糖酸钠对鲤抗感染能力影响及其潜在机制解析： 基于B. velezensis R-71003具有抑制病原菌生长的效果，本研究对养殖试验结束后的鲤进行嗜水气单胞菌攻毒试验，试图探究B. velezensis R-71003联合葡萄糖酸钠对鲤抗感染能力的影响和剖析潜在作用机制。通过腹腔注射200μL 半致死浓度（1×108 CFU/mL）的嗜水气单胞菌，评估攻毒后的鲤死亡率、血清生理生化、载菌量、肝脏非特异性免疫及头肾免疫相关基因表达水平的变化。结果发现，B. velezensis R-71003作为饲料添加剂显著增强鲤感染嗜水气单胞菌后的存活率，提高肝脏AKP、ACP活性，降低感染后血清和肝脏中载菌量，同时通过抑制TLR-4/NF-κB通路降低头肾中IL-1β基因mRNA的表达量，且这些变化在B. velezensis R-71003与葡萄糖酸钠组合添加时效果更显著。此外，B. velezensis R-71003分泌的抗菌蛋白对嗜水气单胞菌细胞壁具有破坏性，可能是增强鲤抵抗嗜水气单胞菌感染的重要物质。研究结果表明，B. velezensis R-71003与葡萄糖酸钠组合能够提高鲤抵抗嗜水气单胞菌感染的能力。 综上，本研究分离出一株B. velezensis R-71003，是潜在的鱼源益生菌，而且，葡萄糖酸钠可促进B. velezensis R-71003的生长。二者作为饲料添加剂联合使用促进鲤的生长和健康状况、增强鲤肠道功能、改善肠道健康、提高抵抗嗜水气单胞菌感染能力的效果优于二者单独使用。研究结果将为贝莱斯芽孢杆菌联合葡萄糖酸钠在绿色水产养殖中的应用提供理论依据，也为如何提高水产益生菌在实践应用中使用效率的研究提供新思路。
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