摘要
目的:内皮功能障碍是脓毒症发生的重要环节。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)是内皮细胞的主要来源，EPCs不仅可促进血管重建，还可发挥免疫调节作用，缓解炎症。高迁移率族蛋白 B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)可由巨噬细胞释放，是重要的免疫调控因子，既可以作为炎症反应释放的产物，也可以与其他免疫调控因子相互作用，调节机体的免疫反应，以促进各种炎症因子的释放。焦亡(Pyroptosis)是一种由Gasdermins(GSDMs)家族介导的依赖于炎性半胱天冬酶(Caspase)的程序性细胞死亡方式，参与包括脓毒症在内的多种疾病的发生与发展。本研究旨在探讨巨噬细胞释放的HMGB1能否诱导EPCs焦亡及其具体机制。 方法:3％巯基乙酸盐肉汤腹腔注射C57BL/6小鼠，获取原代腹腔巨噬细胞;从健康雄性C57BL/6小鼠长骨中分离培养并鉴定EPCs;将巨噬细胞分为 3 组:control(C)组、LPS(L1)组(L1:0.1ug/ml)、LPS+Nigericin(L1N)组，各组巨噬细胞经体外干预后收集细胞上清液，然后用各组巨噬细胞上清液或巨噬细胞上清液+LPS(L2)(L2:1ug/ml)孵育EPCs,即EPCs分为8组:空白对照组、L2组、巨噬细胞C上清组、巨噬细胞L1上清组、巨噬细胞L1N上清组、巨噬细胞C上清+L2组、巨噬细胞L1上清+L2组、巨噬细胞L1N上清+L2组;显微镜下观察EPCs的细胞形态和凋亡相关斑点蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein,ASC-speck)的形成，ELISA 检测 3 组巨噬细胞上清中HMGB1的水平;Western Blot检测巨噬细胞中HMGB1和EPCs中GSDMD的表达;用重组人HMGB1蛋白(rHMGB1)+L2干预 EPCs,检测乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、interleukin-1α(IL-1α)的释放及GSDMD蛋白的表达;抑制巨噬细胞HMGB1表达，然后用巨噬细胞L1N上清+L2孵育EPCs,检测EPCs中GSDMD蛋白的表达;RT-qPCR检测EPCs中HMGB1主要受体RAGE、TLR2、TLR4的表达差异;抑制EPCs中RAGE的表达，然后用巨噬细胞L1N上清+L2孵育EPCs,检测EPCs中GSDMD的表达;免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测 HMGB1 与 RAGE 的结合。 结果:在EPCs各组中，与空白对照组比较，巨噬细胞L1N上清+L2组EPCs中GSDMD-N端蛋白表达水平增高、EPCs细胞形态出现焦亡特征且ASC-speck明显增多，其余各组EPCs细胞形态无明显改变，ASC-speck及GSDMD-N端蛋白表达水平无统计学差异。在巨噬细胞各组中，与C组比较，L1组细胞上清中HMGB1表达水平无统计学差异，L1N组细胞上清中HMGB1表达水平明显增高。巨噬细胞上清中HMGB1表达水平与EPCs中GSDMD-N端蛋白表达量成正相关。rHMGB1+L2干预EPCs 后,EPCs 中 LDH、IL-1α 的释放及 GSDMD-N端蛋白的表达较空白对照组增多;抑制巨噬细胞HMGB1的表达使可下调EPCs中GSDMD-N端的表达水平;EPCs中高表达RAGE;抑制RAGE的表达使EPCs中GSDMD-N端的表达水平明显下调;与空白对照组相比，巨噬细胞L1N上清+L2组EPCs中HMGB1与RAGE的结合增加。 结论:巨噬细胞释放的HMGB1通过与EPCs上的RAGE受体结合，诱导EPCs焦亡。
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