摘要
【目 的】 m6A甲基化修饰相关分子在癌症增殖、迁移和侵袭过程中发挥一定的作用，可作为患者诊断和影响预后的潜在分子标准物。RBM15(RNA-binding motif protein 15，RBM15)作为一种 m6A 修饰甲基转移酶和促癌基因，其促癌作用及相关机制已在多种恶性肿瘤中得到阐明，但RBM15在肺腺癌中的作用机制未完全阐明。因此，本研究旨在探索RBM15对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学功能的调控作用，揭示 RBM15 对肺腺癌生物学功能调控的分子机制，明确RBM15 与肺腺癌预后的相关性，为肺腺癌的治疗提供新的潜在靶点，并有利于提高肺腺癌的个体化精准治疗及预后。 【方 法】 本研究分为三部分： 1. RBM15对肺腺癌生物学功能调控的探索 1.1 在肺腺癌中RBM15、m6A甲基化的表达情况的研究： 利用免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）染色的方法检测在40例肺腺癌及正常组织中RBM15的蛋白表达情况；Western-Blot和qPCR检测12对肺腺癌及正常组织中RBM15蛋白和mRNA的表达情况；采用斑点实验检测12对肺腺癌及正常组织中m6A甲基化修饰情况。 1.2 RBM15对肺腺癌生物学功能调控的研究： 在H1734、H1299、A549、SPC-A1、H838这5株肺腺癌细胞中根据细胞中RBM15的蛋白和mRNA表达情况以及m6A甲基化水平选择实验细胞；采用慢病毒转染技术构建RBM15的过表达和敲低A549、H1734细胞；斑点实验检验过表达和敲低A549、H1734细胞中m6A甲基化水平；在细胞水平上评价RBM15在细胞侵袭、迁移、增殖中的作用；在动物水平上评价RBM15对A549细胞在裸鼠皮下移植瘤形成中的作用。 2. RBM15 对肺腺癌生物学功能调控的分子机制研究 2.1 筛选RBM15互作蛋白的研究： 对过表达以及敲低的A549细胞进行MeRIP-seq和转录组测序筛选RBM15的下游靶点；利用生物信息学技术以及qPCR筛选出RBM15的下游靶点RASSF8；采用免疫组织化学染色评价肿瘤组织中RASSF8的表达水平；MeRIP-qPCR技术阐释RBM15对RASSF8的相互作用以及RASSF8介导的m6A的丰富程度；RNA免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因实验发现RASSF8介导的m6A甲基化修饰具体作用位点。 2.2 RBM15抑制RASSF8表达促进上皮-间质的转化影响肺腺癌细胞迁移、侵袭的作用研究： 从细胞水平揭示RBM15对RASSF8的调控作用，从细胞水平上利用RNA稳定性实验验证RBM15对RASSF8的转录影响；从细胞水平揭示RBM15抑制RASSF8表达促进上皮-间质转化的调节作用；通过回复实验证明RBM15抑制RASSF8的表达在影响上皮-间质转化的调节作用，通过回复实验证明在肺腺癌细胞中RBM15抑制RASSF8表达的生物学功能的作用。 3. RBM15与肺腺癌预后的相关性研究 收集昆明医科大学第三附属医院经手术后病理确诊为肺腺癌患者的临床资料和组织蜡块，应用免疫组化等技术评价肿瘤组织中RBM15蛋白的表达水平；绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线），选取使得约登指数（Youden）最大的RBM15阳性率的中位值作为截断值（cut off value），以该截断值将肺腺癌患者分为高表达组和低表达组，采用Kaplan-Meier法计算累积生存率；使用Log-rank检测比较RBM15的高表达组与低表达组患者的生存差异；使用Cox回归分析模型进行预后多因素分析，确定肺腺癌预后不良的危险因素。 【结 果】 1. RBM15对肺腺癌生物学功能的调控 1.1 在肺腺癌中RBM15、m6A甲基化水平的表达： 1）相对正常组织RBM15在肺腺癌组织中蛋白、mRNA表达量明显升高。 2）相对正常组织m6A甲基化修饰水平在肺腺癌组织中升高。 1.2 RBM15对肺腺癌生物学功能调控的作用： 1）选用RBM15蛋白、mRNA表达水平居中且都能发生m6A甲基化修饰的A549、H1734细胞作为实验细胞进行过表达及敲低双向调节验证。 2）成功构建RBM15过表达、敲低的A549、H1734细胞。 3）过表达RBM15，能显著增加A549、H1734细胞中m6A甲基化修饰水平；敲低RBM15，能显著抑制A549、H1734细胞中m6A甲基化修饰水平。 4）过表达RBM15，能显著促进A549、H1734细胞侵袭、迁移、增殖能力；敲低RBM15，能显著抑制A549、H1734细胞侵袭、迁移、增殖能力。 5）敲低RBM15能抑制A549细胞在裸鼠皮下成瘤，抑制m6A甲基化修饰水平。 2. RBM15 对肺腺癌生物学功能调控的分子机制 2.1 筛选出RBM15互作蛋白-RASSF8： 1）RNA-seq和MeRIP-seq测序基因进行韦恩分析发现46个与RBM15高度相关的基因；对46个高度相关的基因通过生物信息学分析发现HNRNPH1、RASSF8、GORASP1、DICER1、PEAK1、ERBB2这6个基因在癌组织和正常组织中存在统计学差异。 2）在过表达和敲低RBM15的A549细胞中，ERBB2 mRNA、RASSF8 mRNA、PEAK1 mRNA、DICER1 mRNA与RBM15 mRNA具有相关性。 3） ERBB2、RASSF8、PEAK1、DICER1 的启动子区都存在 m6A 甲基化的位点，且RASSF8的甲基化丰富程度最稳定，筛选出参与细胞粘附的RBM15互作蛋白-RASSF8。 4）RASSF8蛋白在肺腺癌组织中表达量低于正常组织。 5） RBM15蛋白与RASSF8蛋白共定位在A549、H1734细胞的细胞质中；RBM15蛋白与RASSF8蛋白的直接作用经免疫沉淀实验证明。 6）在RASSF8野生型中荧光素酶活性的相对比值在RBM15过表达株中降低，在RASSF8缺失型中RBM15过表达不影响荧光素酶活性。 7）在A549-NC细胞中，与IgG相比anti-m6A组的RASSF8甲基化丰富度显著升高，在anti-m6A富集下过表达RBM15的A549细胞中RASSF8甲基化丰富度升高。 2.2 RBM15抑制RASSF8表达促进上皮-间质的转化影响肺腺癌细胞迁移、侵袭的作用： 1）RBM15抑制RASSF8蛋白的表达，RBM15蛋白表达不可以被RASSF8回复。 2）RBM15可以与RASSF8mRNA特异性结合并在转录后抑制RASSF8mRNA的表达。 3）RBM15抑制RASSF8表达促进肺腺癌细胞上皮-间质转化。 4）RBM15对A549、H1734细胞的侵袭、迁移的抑制作用可以部分被RASSF8回复。 5）RBM15对A549、H1734细胞的增殖作用不可以被RASSF8回复。 3. RBM15在肺腺癌中的预后预测价值 1）在符合纳入和排除标准的80例肺腺癌组织及癌旁正常组织中，RBM15蛋白在癌组织中表达水平高于癌旁正常组织。 2）当约登指数最大时RBM15阳性率为11.12，将RBM15阳性率≥11.12的肺腺癌患者定义为RBM15高表达组，而将RBM15阳性率＜11.12的肺腺癌患者定义为RBM15低表达组；RBM15高表达组肺腺癌患者总体生存期短于RBM15低表达组患者。 3）RBM15蛋白表达与肺腺癌患者年龄、是否吸烟和N分期相关。 4）RBM15高表达是肺腺癌患者预后不良的危险因素之一。 【结 论】 1. 在肺腺癌组织和细胞中发生了RBM15介导的m6A甲基化修饰，RBM15介导的m6A修饰促进肺腺癌细胞侵袭、迁移和增殖，敲低RBM15能抑制肺腺癌细胞在裸鼠体内形成移植瘤以及抑制m6A甲基化修饰水平，提示RBM15可能是反映肺腺癌细胞侵袭、迁移、增殖的潜在的分子标志物。 2. RBM15介导的m6A修饰能够抑制与其共定位于细胞质的RASSF8蛋白表达，提高RASSF8甲基化丰富度，促进上皮-间质转化影响肺腺癌细胞的迁移、侵袭， RBM15调控RASSF8介导m6A修饰可能是肺腺癌细胞迁移、侵袭的作用机制。 3. RBM15在肺腺癌组织中表达升高，RBM15高表达预示着患者预后不良，可能是判断肺腺癌患者预后的指标之一。
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