摘要
艾美耳球虫（Eimeria spp.）是重要的胞内寄生原虫，其属内多个虫种可感染奶牛并导致其严重的腹泻，甚至死亡。但目前我们对于奶牛中艾美耳球虫的流行情况和感染动态认识有限。已有的研究大多是基于显微镜检测的横断面调查，检测灵敏度低，主观性高，易造成误判，且无法解析艾美耳球虫的动态感染模式。因此，急需建立有效的分子诊断工具，并在奶牛中开展艾美耳球虫的出生队列研究，以准确解析艾美耳球虫动态感染模式。 为此，本研究在广东某集约化奶牛养殖场中，随机选择了21头纯种荷斯坦奶牛，从其出生起进行了为期9个月的艾美耳球虫感染跟踪调查。首先，采用显微镜检测技术，进行艾美耳球虫的检测、虫种鉴定和计数。结果显示，总体上艾美耳球虫的累计感染率为100％（21/21），感染的虫种包括：柱状艾美耳球虫、牛艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫和奥博艾美耳球虫，各个虫种的累计感染率、平均感染时长以及感染时期存在差异。柱状艾美耳球虫最早出现，在犊牛3周龄时被检出，在4周龄时达到首个感染高峰（85.7％），在14～15周龄时到达第二个感染高峰（14.3％），平均感染时长为2.5周。牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫出现于犊牛4周龄，分别于第4周龄（38.1％）和第5周龄达到感染高峰（33.3％），之后感染率逐步降至0，在10周龄后出现第二个感染周期，两者平均感染时长分别为1.9和1.5周，累计感染率分别为85.7％（18/21）和52.4％（11/21）。奥博艾美耳球虫出现最晚，在犊牛11周龄时才出现，在12周龄达到感染高峰（23.8％），其平均感染时长为1.2周，累计感染率为57.1%（12/21）。以上虫种中，柱状艾美耳球虫的OPG（每克粪便中的卵囊量）显著高于其他三个虫种（OPG＜2.3×104）。而且，所有虫种第二个感染高峰期的OPG明显低于第一个感染高峰期。进一步的卡方分析显示，仅奥博艾美耳球虫与腹泻相关（P=0.009）。此外，本研究还发现，奶牛中各个虫种的混合感染情况非常严重，尤其在断奶后犊牛中，常出现多个虫种低强度的混合感染。以上说明，艾美耳球虫在奶牛中广泛存在，并且存在多虫种的交替感染，这可能与虫种特异性的免疫力相关。 进一步，基于常见牛源艾美耳球虫的SSU rRNA位点，建立巢式PCR检测方法。该方法的检测下限为50个卵囊，且只能扩增艾美耳球虫，而且通过一个PCR反应和产物测序就可扩增和区分样本中的多个虫种。采用该方法，对采集的奶牛样本进行分析，除了检测到显微镜检测发现的虫种外，还检测到了怀俄明艾美耳球虫和加拿大艾美耳球虫。虽然PCR方法的检出率（64.6％，309/478）明显高于显微镜检测（17.2％，84/478），但基于PCR方法分析所得的艾美耳球虫感染动态变化趋势与显微镜检测结果一致。以上结果表明，新建立的PCR检测方法灵敏度高、特异性强，而且可以用于临床混合样本的检测。 综上，本研究解析了集约化养殖奶牛中艾美耳球虫多个虫种动态感染模式，并建立了可用于临床样本的艾美耳球虫PCR检测方法，为艾美耳球虫的防控提供了理论依据和技术支持。
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