摘要
荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii）隶属于卵菌门，其引起的荔枝霜疫病是影响荔枝产量与质量的主要病害。前期通过大规模的免疫反应筛选发现荔枝霜疫霉RXLR效应蛋白PlAvh23能引起烟草的过敏性坏死，但其毒性和作用机制尚不明确。本研究通过RNAi、蛋白质互作、植物瞬时表达和VIGS等技术，探究了PlAvh23的毒性功能、寄主靶标蛋白和靶标蛋白的功能。主要的研究结果如下： 1.通过PEG介导的原生质体转化导入pTORmRFP4重组质粒，分别得到了2个PlAvh23沉默突变体和1个过表达突变体，通过对突变体的生长速率测定发现PlAvh23的沉默和过表达不影响荔枝霜疫霉的生长速率；将突变体的游动孢子接种于荔枝叶片，2个沉默突变体的致病力显著下降，而过表达突变体的致病力显著提升；表明PlAvh23不影响菌株的生长速率，但对其致病力发挥重要作用。 2.通过农杆菌介导的瞬时转化技术，使PlAvh23在本氏烟中瞬时表达，并接种辣椒疫霉。当农杆菌的OD600=0.05时，PlAvh23的表达能促进辣椒疫霉的侵染；当农杆菌的OD600=0.1时，PlAvh23的表达抑制辣椒疫霉的侵染；表明PlAvh23能影响本氏烟对辣椒疫霉的抗性。 3.通过酵母双杂交技术，以PlAvh23为诱饵蛋白对荔枝cDNA文库进行筛选，共得到141个候选互作蛋白，通过酵母一对一验证、GST-pulldown和免疫共沉淀技术，进一步明确了LcMKK9与PlAvh23的互作关系，且亚细胞定位结果显示PlAvh23与LcMKK9在细胞核中有共定位。 4.通过RT-qPCR分析LcMKK9在荔枝霜疫霉侵染荔枝叶片、枝条、花和果实的过程中转录情况，结果显示LcMKK9在病原菌侵染过程中显著上调表达。 5.LcMKK9在本氏烟中瞬时表达会引起烟草活性氧的积累和细胞的坏死，且LcMKK9的激酶结构域和MAPK对接位点是其引起细胞坏死的关键区域，第82、174amp;175、213位氨基酸是其引起坏死的关键氨基酸。进一步将LcMKK9在本氏烟中瞬时表达后接种辣椒疫霉，发现LcMKK9的表达抑制辣椒疫霉的侵染，在本氏烟中沉默LcMKK9的同源基因NbMKK1能促进辣椒疫霉的侵染，表明LcMKK9正向调控植物免疫。 6.突变LcMKK9第213位苏氨酸使LcMKK9和PlAvh23的互作减弱，且PlAvh23与LcMKK9共表达显著降低LcMKK9的蛋白丰度。 以上结果表明PlAvh23对荔枝霜疫霉毒力有重要作用，并且会影响植物对病原卵菌的抗性，其寄主靶标蛋白LcMKK9能引起包括活性氧迸发和细胞坏死在内的植物免疫反应，并且其激酶结构域对其引起细胞坏死的功能有重要作用；此外LcMKK9对植物免疫起正调控作用，PlAvh23可能通过降低LcMKK9的蛋白丰度从而抑制植物免疫。本研究在分子和蛋白水平上了解荔枝霜疫霉RXLR效应蛋白PlAvh23的具体作用，以及与寄主靶标蛋白的互作机制，研究结果为制定新型防控策略及荔枝抗病育种提供一定的理论依据。
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