摘要
鸡肉作为一种价廉质优的蛋白质来源，是我国仅次于猪肉的第二大肉类消费品。在家禽生产中，产肉量和肉质是影响经济效益的重要指标，前者主要受肌肉发育影响，后者则受到肌内脂肪分布和脂质沉积的影响。 前期研究发现，新型跨膜蛋白TMEM182特异表达于鸡的肌肉组织和脂肪组织，通过抑制成肌细胞分化及融合、参与鸡脂肪的合成代谢，从而影响鸡的成肌成脂过程。因此，利用基因工程对鸡TMEM182基因进行遗传修饰，对于培育高产优良的肉鸡新品种，大幅缩短育种年限具有重要意义。 原始生殖细胞（PGCs）是精子/卵子的前体细胞，能将遗传信息传递给后代。将PGCs经过体外培养以及基因修饰后，移植到受体鸡胚内产生性腺嵌合体，是制备基因编辑鸡的一个理想方法。 在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑工具对鸡原始生殖细胞(PGCs)的TMEM182基因进行敲除，以期制备TMEM182基因缺陷的性腺嵌合体鸡。 首先，为了研究鸡TMEM182基因的进化特征，我们对家禽和哺乳类动物共计8个物种的TMEM182基因的DNA序列、mRNA序列以及蛋白序列进行同源性分析，绘制了系统进化树。结果显示：在各物种间，TMEM182的蛋白序列高度保守，mRNA次之，据此推测TMEM182蛋白在不同物种间能够发挥相同的功能。采集鸡胚的心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、脑、腹脂等组织，用qPCR检测TMEM182基因在鸡胚发育早期不同组织的相对表达量，发现TMEM182基因特异表达于腿肌、胸肌和腹脂中，说明TMEM182基因从鸡胚发育早期就参与成肌成脂过程。 其次，我们从发育至Hamburger-Hamilton(HH)的28-30阶段鸡胚中分离出PGCs，经过体外培养后，利用PAS染色、免疫荧光化学染色、RT-PCR等方法对其鉴定，同时也对其性腺迁移能力进行鉴定。结果表明，PGCs在体外培养的过程中仍能保留其生物学特性。 随后，为提高CRISPR/Cas9的打靶效率，我们针对TMEM182基因的第二外显子选择3个sgRNA,在DF-1细胞上进行打靶效率验证，其中TMEM182-sgRNA1的打靶效率最高。此外，为提高基因编辑的安全性和精确性，我们用基于碱基替换的策略在TMEM182基因提前引入终止子，实现TMEM182基因敲除。 最后，制备TMEM182基因缺陷的性腺嵌合体鸡。为了便于追踪，我们通过HMEJamp;nbsp;基因整合策略将外源基因mCherry定点插入到PGCs的TMEM182基因的第二外显子区，造成TMEM182基因的插入突变，通过流式分选，得到能稳定表达红色荧光的mCherry＋PGCs，将其注入到发育至2.5d的受体鸡胚。注射后第4.5天，采集受体鸡胚的性腺，可观察到性腺存在大量的mCherry+细胞；另一部分鸡胚继续孵化至出壳，最终得到10只小鸡。以上结果表明，本研究成功获得了TMEM182基因缺陷的性腺嵌合体鸡。
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