摘要
黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物。在已鉴定出的大约20种黄曲霉毒素中，AFB1的毒性最大，被认为是最强的天然肝癌致癌物，并被国际癌症研究机构列为I类致癌物。AFB1是一种惰性化合物，它的毒性依赖于细胞色素P450（Cytochrome P450,CYP）将其激活形成高活性和亲电性的AFB1-8,9-环氧化物（AFB1-8,9-epoxide，AFBO）。饲料在运输和贮存过程中极容易被AFB1污染，致使猪接触到AFB1的概率远高于人和其他动物。AFB1的活化代谢机制在人体内已被研究比较明确。然而，却鲜有文献报道AFB1在猪体内的代谢转化过程。本实验室前期通过体外蛋白重组实验已证明猪CYP1A2、CYP2A19、CYP3A29和CYP3A46在AFB1的代谢活化过程中发挥作用。但在猪肝脏中，AFB1活化代谢产物以及主要参与AFB1激活为高毒性AFBO这一过程的CYP亚型尚不清楚。 本研究采集了18头来自不同品种、性别和年龄的猪的肝脏，并利用差速离心法获得猪肝微粒体（Porcine Liver Microsomes，PLM），检测18个PLM代谢AFB1的活性。结果显示PLM代谢AFB1主要生成AFBO和少量AFM1/AFQ1，将产物AFBO的生成速率V与CYP1A、2A和3A蛋白模式底物的代谢速率V进行相关性分析后，AFBO的生成与CYP2A和3A蛋白具有较高的相关性。在PLM与AFB1孵育中添加高度同源的人CYP蛋白抗体作为抑制剂分别抑制PLM中四个CYP亚型活性。利用抑制剂充分抑制猪CYP1A2后，产物AFBO减少了23.8%；充分抑制猪CYP2A19后，产物AFBO减少了31.1%；充分抑制猪CYP3A29/46后，产物AFBO减少了50.3%。由此，我们发现猪CYP2A19和CYP3A29/46是PLM中催化AFB1代谢生成AFBO的主要亚型。 AFBO的构型分为外环氧和内环氧两种，外环氧AFBO具有强烈的毒性。为了鉴定PLM代谢AFB1的产物AFBO的构型。我们在永生化猪肝脏细胞（HepLi）稳转了猪CYP1A2、CYP2A19、CYP3A29和CYP3A46蛋白。在不同浓度AFB1处理下，我们发现CYP2A19的稳转HepLi细胞对AFB1毒性极其敏感。通过免疫荧光技术检测稳转细胞内AFBO与DNA的加合物（AFB1-DNA），我们发现CYP2A19的稳转HepLi细胞荧光强度明显强于其余三个稳转细胞系，并且CYP2A19的稳转HepLi细胞内活性氧含量同样高于其他三个稳转细胞系。 综上所述，本研究鉴定了猪肝微粒体蛋白代谢AFB1主要生成AFBO和少量的AFM1/AFQ1，其中高毒性外环氧AFBO主要由猪CYP2A19代谢AFB1产生，大部分的内环氧AFBO由猪CYP3A29/46催化。本研究证明了猪CYP2A19是猪肝脏中代谢AFB1发挥毒性的重要亚型，揭示了猪肝脏中AFB1有毒有害代谢物形成的机制，为筛选调控其催化活性的天然化学保护剂和关键氨基酸位点以减弱AFB1的肝细胞毒性提供重要参考，对于畜禽健康生产及其产品安全有重要意义。
NETL