摘要
人工授精技术（artificial insemination,AI）已广泛应用于畜牧业生产，可大幅提高优良公猪的利用效率。公猪精液质量与授精能力和产仔数等重要繁殖性状密切相关。由于精子转录水平上相对沉默，相较于其他细胞更依赖于转录后修饰机制的调控。已有研究发现microRNA（miRNA）等转录后调控因子参与精子功能的调控。胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）作为重要的细胞间通讯工具，可以通过选择性运输携带的调控因子参与多种生物学过程。已有研究显示精浆中也含有大量的EVs，并有可能通过将miRNAs运输进入精子参与精子功能的调控。对精浆胞外囊泡（seminal plasma-derived extracellular vesicles,SP-EVs）miRNAs的研究，可为改良公猪精液质量提供重要参考，目前相关研究少有报道。 本研究旨在分离鉴定SP-EVs，并通过small RNA（sRNA）测序技术，寻找猪SP-EVs中参与精子功能调控的关键miRNAs，同时验证该miRNA由SP-EVs选择性运输进入精子，最后对该miRNA的功能和分子机制进行探究。主要研究结果如下： 1.通过超速离心法分离了猪SP-EVs，并使用透射电镜（transmission electron microscope,TEM）、纳米粒子跟踪分析鉴定技术（nanoparticle tracking analysis,NTA）以及western blot对分离得到的SP-EVs样品的结构、粒径大小以及表面蛋白进行检测，证明分离得到的样品是纯净的猪SP-EVs； 2.通过sRNA测序技术，在猪SP-EVs中共鉴定到了288个miRNAs，并使用RT-qPCR验证了测序数据的准确性，其中表达量最高的前十个miRNAs占miRNA reads的81.59%，而ssc-miR-21-5p作为SP-EVs中表达量最高的miRNA（19.72%），可能是参与精子功能调控的主效因子。 3.通过pkH67示踪实验和RT-qPCR证明了ssc-miR-21-5p由SP-EVs运输进入精子；进一步试验通过脂质体转染法，建立精子ssc-miR-21-5p过表达和低表达模型，并发现ssc-miR-21-5p对精子获能有抑制作用。 4.通过生物学信息分析，预测到VCL基因为ssc-miR-21-5p的潜在靶点，并通过双荧光素酶报告基因实验、RT-qPCT和western blot实验，分别从体外和体内验证ssc-miR-21-5p对VCL基因的抑制作用；进一步通过使用免疫荧光和VCL蛋白抑制剂，证明ssc-miR-21-5p通过靶向VCL基因抑制精子获能。 5.通过顶体完整性检测试验，证明在体外保存过程中，ssc-miR-21-5p可以维持精子顶体的完整性。 综上所述，本论文分离并鉴定了猪SP-EVs；同时使用转录组学技术解析了SP-EVs miRNAs表达谱，发现并验证了ssc-miR-21-5p由SP-EVs选择性运输进入精子从而通过靶向VCL基因抑制精子获能以及在体外保存过程中维持精子顶体完整性。
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