摘要
脑积水是出血性脑卒中后患者预后不良的危险因素。研究表明，脑出血后，血液成分在出血后脑积水的发生、发展中起着关键作用。凝血酶是重要的血液成分，既往研究表明其可促进出血后脑积水的发生。然而，凝血酶诱导脑积水的具体病理改变及潜在机制仍不清楚。 在人类中，性别是影响出血性卒中后继发脑损伤严重程度的重要因素，而其中的具体机制仍未可知。研究提示，雌激素可通过调节中性粒细胞趋化性来参与多种疾病的病理过程。 本研究拟分为三个部分来研究凝血酶对脑积水的影响:1、基于脑室内注射凝血酶以构建鼠脑积水模型，通过影像学手段评估了脑积水严重程度，并在组织学水平观察其病理改变;2、探讨性别对凝血酶诱导鼠脑积水模型的影响及其机制;3、探讨中性粒细胞在凝血酶诱导鼠脑积水及其性别差异中的作用。 第一部分.构建脑室内注射凝血酶诱导鼠脑积水模型 目的:构建脑室内注射凝血酶诱导鼠脑积水模型，通过影像学手段评估脑室体积，并在组织学水平其病理改变。 方法:1、实验组成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠接受单侧脑室内注射3个单位(unit，U)凝血酶，对照组大鼠接受等体积生理盐水(50μ1)注射，以建立大鼠脑积水模型。2、实验组成年雄性CD-1小鼠接受脑室内注射1U凝血酶，对照组小鼠接受等体积的生理盐水(10μl)注射，以建立小鼠脑积水模型。所有实验动物在注射24小时后使用磁共振T2加权成像(T2 weighted imaging,T2WI)评估脑室体积和脑室旁白质肿胀程度;检查后予以安乐死处理，所得脑组织制作新鲜冰冻切片用于苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,H&E)染色和免疫组化染色，以在组织学水平观察病理改变。 结果:在大鼠脑积水模型中:脑室内注射凝血酶24小时后，T2WI可检测到雄性大鼠明显的脑室扩张(23.1±5.1vs.8.5±0.8mm3,p＜0.01)和脑室旁白质肿胀(3.6±2.1vs.1.2±0.8mm3，p＜0.05)。在组织学上，凝血酶可导致雄性大鼠脑室壁破坏(26.3±8.1％vs.4.3±2.0％,p＜0.01)，并且在大鼠脉络丛、脑室壁及脑室旁白质肿胀区域可观察到中性粒细胞浸润。在小鼠脑积水模型中:脑室内注射凝血酶后24小时可诱导雄性小鼠脑积水(5.16±1.43vs.2.17±0.47mm3,p＜0.01)及脑室旁白质肿胀(0.7±0.8vs.0mm3,p＜0.05)。在小鼠脉络丛中可观察到显著的中性粒细胞浸润(524±92vs.0个/mm2,p＜0.01)。凝血酶可激活小鼠脉络丛的丛上细胞(Iba1阳性细胞:10.98±1.98％vs.3.72±1.21％;p＜0.01;CD68 阳性细胞:1.62±1.25％vs.6.54±1.52％;p＜0.01)。脑室旁白质肿胀区域也可观察到中性粒细胞浸润(203±165vs.0个/mm2,p＜0.05)。 结论:脑室内注射凝血酶可导致雄性大鼠及雄性小鼠的脑室扩张及脑室旁白质肿胀。在组织学上，凝血酶诱导的大、小鼠模型中可观察到相似的病理变化，为进一步探索凝血酶在出血后脑积水形成的研究提供不同的模型。 第二部分.性别对凝血酶诱导大鼠脑积水的影响 目的:探讨不同性别成年SD大鼠在脑室内注射凝血酶后的脑室和白质的变化，并探究其潜在机制。 方法:1、成年雄、雌性大鼠接受单侧脑室内注射5U的凝血酶，以评估注射24小时后大鼠的死亡率;2、然后，实验组雌性大鼠脑室内注射3U凝血酶，对照组雌性大鼠接受等体积生理盐水注射，并纳入第一部分研究中雄性大鼠的磁共振数据及新鲜冰冻切片作为第二部分的雄性组，以观察不同性别大鼠的脑室体积及脑室旁白质的改变;3、实验组雄性大鼠在脑室内注射3U凝血酶前24小时及2小时以17-β雌二醇(5mg/kg，腹腔注射)进行处理，对照组雄性大鼠以等量溶剂，以验证凝血酶诱导不同性别大鼠的脑积水差异是否由雌激素介导。所有大鼠均在注射24小时后进行T2WI检查，并予以安乐死处理，所得脑组织制作新鲜冰冻切片用于H&E和免疫组化染色。 结果:雌性和雄性大鼠脑室内注射5U凝血酶后中的死亡率分别是100％和0％。脑室内注射3U凝血酶在雌性大鼠中导致更大的脑室体积(36.1±12.5vs.23.1±5.1mm3，p＜0.05)、更明显白质肿胀(12.8±8.2vs.3.6±2.1mm3,p＜0.01)以及更严重的脑室壁损伤(40.9±8.5％vs.26.3±8.1％，p＜0.05)。在雌性大鼠中，脉络丛和白质肿胀区域的中性粒细胞数显著多于雄性大鼠(脉络丛:938±313vs.576±216 个/mm2,p＜0.01;白质:1092±680vs.281±284 个/mm2,p＜0.05)。与溶剂预处组相比，17-β雌二醇预处理后，雄性大鼠组脑室内注射凝血酶可导致更大的脑室体积(36.0±9.8vs.23.4±3.5mm3,p＜0.05)、更严重的脑室旁白质肿胀(10.5±7.2vs.2.5±3.2mm3,p＜0.05)以及更多的脉络丛和白质肿胀区域中性粒细胞数(脉络丛:1142±646vs.452±144个/mm2,p＜0.05;白质:721±500vs.205±249个/mm2,p＜0.05)。线性回归分析显示脉络丛中性粒细胞与脑室体积呈正相关(r=0.65,p＜0.0005);白质肿胀区域内的中性粒细胞数量与白质肿胀区域体积呈正相关(r=0.84,p＜0.0001)。 结论:脑室内注射凝血酶诱导的大鼠脑积水存在性别差异，且雌性大鼠的脑积水更为明显。雌激素可能通过募集中性粒细胞以介导凝血酶诱导脑积水的性别差异。了解凝血酶诱导脑损伤后的性别差异有助于出血性脑卒中的个体化干预治疗。 第三部分.耗竭中性粒细胞可减轻凝血酶诱导的小鼠脑积水 目的:探讨外周血中性粒细胞耗竭后对凝血酶诱导CD-1小鼠脑积水影响。 方法:1、实验组雄性小鼠在注射凝血酶(1U)前24小时及前5分钟予以抗Ly6G中和抗体(0.5mg/只，腹腔注射)处理，对照组予以等量IgG2A，以验证中性粒细胞对凝血酶诱导的雄性小鼠脑积水的影响;2、实验组成年雌性小鼠接受脑室内注射凝血酶，对照组接受生理盐水注射，并纳入第一部分研究中雄性小鼠的磁共振数据及MPO阳性细胞数据，以验证凝血酶诱导脑积水的性别差异是否存在于小鼠中;3、实验组雌性小鼠脑室内注射凝血酶前24小时及前5分钟予以小鼠抗Ly6G中和抗体，对照组予以IgG2A，以验证中性粒细胞对凝血酶诱导的雌性小鼠脑积水的影响，并检验耗竭中性粒细胞后凝血酶诱导的脑积水的性别差异是否消除。所有小鼠均在注射24小时后进行T2WI检查，并处以安乐死，所得脑组织制作新鲜冰冻切片用于H&E和免疫组化染色。 结果:腹腔内注射小鼠抗Ly6G中和抗体24小时后，雄性小鼠外周血中心粒细胞可被明显耗竭(36.17±6.24％vs.4.83±1.72％;p＜0.01)。中性粒细胞耗竭可减轻脑室内注射凝血酶诱导的雄性小鼠的脑室扩张(抗Ly6G组:中位数=2.82mm3;IgG2A对照组:中位数=4.34mm3;p＜0.01)，减少脉络丛上Iba1阳性细胞数(5.47±1.69％vs.9.77±1.76％;p＜0.01)，以及 CD68 阳性细胞数(1.62±1.25％vs.6.54±1.52％;p＜0.01)。然而，中性粒细胞耗竭未缓解凝血酶诱导的雄性脑室旁白质肿胀(2.70±0.54％vs.4.62±1.26mm3;p＞0.05)。脑室内注射凝血酶可导致雌性小鼠脑室扩张(7.71±1.59vs.2.36±0.31 mm3,p＜0.01)以及脉络丛中显著的中性粒细胞浸润(凝血酶组:中位数=717.0个/mm2;盐水组:中位数=0个/mm2;p＜0.05)。雌性小鼠在注射凝血酶后的脑室体积要大于雄性小鼠(7.71±1.59vs.5.16±1.43mm3,p＜0.05)。中性粒细胞耗竭可减轻凝血酶诱导的雌性小鼠的脑积水(3.50±1.02vs.7.07±2.01 mm3,p＜0.01)。此外，中性粒细胞耗竭后，凝血酶诱导的雌雄性小鼠脑室扩张的差异消失(3.50±1.02vs.2.70±0.54mm3,p＞0.05)。 结论:中性粒细胞耗竭可减轻脑室内注射凝血酶诱导小鼠脑积水的程度及脉络炎症的激活，但未减缓凝血酶诱导的脑室旁白质肿胀。中性粒细胞耗竭可消除凝血酶诱导脑室扩张的性别差异。针对中性粒细胞的干预措施可能是治疗出血后脑积水的一个潜在治疗策略。
NETL