摘要
非洲猪瘟（ASF）是一种对家猪和野猪具有高度致死性的急性传染病，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。由于至今仍没有具有完全保护效力的商品化ASFV疫苗，控制疾病只能通过有效诊断、扑杀受感染和接触过的动物以及严格的卫生措施。因此当前ASF疫情防控任务仍非常艰巨，急需对新型疫苗进行探索研究。本研究选取ASFV重要的结构蛋白p72（由B646L基因编码）及其伴侣蛋白pB602L（由B602L基因编码）作为目的抗原蛋白，借助减毒伪狂犬病毒活载体表达系统，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建表达ASFV结构蛋白p72及其伴侣蛋白的减毒重组伪狂犬病毒rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L，并对其在小鼠模型和仔猪模型中的安全性和免疫原性进行评价，以期形成对ASFV重组减毒伪狂犬病毒的初步探索，为研究开发出有效的ASFV疫苗提供思路，对于非洲猪瘟的防控具有一定的战略意义。 1.ASFVP72蛋白和B602L蛋白的多肽间接ELISA方法的建立 以实验室保存的带有ASFVPIG/HLJ/2018毒株B646L和B602L全长基因序列的pEGFP-gI28k-B602L-B646L转移载体为模板，扩增B646L和B602L基因。将截短的B646L和B602L基因插入原核表达载体pColdTF中，构建原核表达载体pColdTF-p72和pColdTF-B602L，并优化其在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达条件。将纯化的重组p72蛋白与B602L蛋白免疫小鼠，获得了效价达到1:128000的多克隆抗体，并通过Westernblot试验证明了所制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。 以制备的鼠源高效价多克隆抗体为阳性血清，合成p72与B602L蛋白短肽作为包被抗原。使用方阵滴定法确定短肽最佳包被浓度和血清稀释度，再进一步对最佳封闭条件、酶标抗体结合时间、显色时间等条件进行优化，成功建立高效、准确的ASFVP72蛋白和B602L蛋白的鼠源多肽间接ELISA方法。 2.表达ASFVB646L和B602L基因的重组伪狂犬毒株的构建及部分生物学特性研究 基于实验室先前构建的伪狂犬病毒CRISPR/Cas9基因编辑体系，以pEGFP-gI28k-B602L-B646L为供体质粒。将CRISPR质粒与供体质粒共转染，病毒基因组在Cas9蛋白靶位点被切割，并通过同源定向修复（HDR）途径修复。从而删除PRVgI和gE基因，将目的基因（5187bp）的片段插入到DNA缺失位点，成功构建了表达ASFV结构蛋白p72及其伴侣蛋白的减毒重组伪狂犬病毒rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L，并进行了部分生物学特性研究。结果显示rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L和rPRVXJ-EGFP毒力相似，和野毒株PRVXJ相比毒力大幅降低，在透射电镜下三者存在相似的病毒粒子形态，均呈现伪狂犬病毒的典型结构。同时重组病毒可以稳定表达p72和B602L蛋白，并重组片段对毒株的增殖能力没有较大影响。 3.rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L重组病毒免疫原性研究 本章开展重组病毒rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L在小鼠和仔猪体内的安全性和免疫原性评价，检测ASFV、PRV特异性抗体和淋巴细胞增殖实验等免疫原性评价指标。小鼠实验结果显示，在安全性方面，rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L在小鼠中使用是安全的。重组病毒可在小鼠体内诱导针对非洲猪瘟p72和B602L蛋白特异性的体液免疫，并且重组片段不影响病毒产生PRVgB抗体，100%保护小鼠免受PRVXJ强毒株的攻击。rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L接种组的脾淋巴细胞在纯化的p72蛋白刺激下表现出增殖反应增加，并显示出高水平的p72和B602L特异性IFN-γ分泌细胞，免疫28d后特异性IFN-γ分泌细胞数量显著高于14d免疫小鼠。重组病毒免疫组血液中均有高水平IFN-γ和IL-4，提示重组病毒诱导产生良好的体液免疫和细胞免疫。重组毒株均能激活CD4+和CD8+T细胞，rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L激活T细胞的能力强于的rPRVXJ-EGFP。 仔猪实验结果显示，在安全性方面，断奶仔猪接种不同浓度的rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L后未出现不良反应，临床表现均正常。在免疫原性方面，断奶仔猪在接种rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L后第三周所有特异性抗体全部转阳，同时免疫组IL-2、IFN-γ细胞因子出现显著上调。免疫仔猪攻毒保护实验结果表明，rPRVXJ-EGFP/B602L/B646L能够为免疫仔猪提供对PRVXJ毒株的完全保护，降低PRV野毒株造成的各器官病理损伤。
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