摘要
目的:本研究基于高通量测序与生信分析结果，探究锌指蛋白503(ZNF503)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨/成脂分化的调控作用及分子机制，明确hBMSCs分化关键影响因素，为骨质疏松症的防治工作提供新思路。 方法:对shZNF503稳转敲低型hBMSCs进行成骨/成脂诱导分化，回收RNA进行高通量测序，进行生信分析。体外实验中，对成骨/成脂诱导分化的野生型和shZNF503敲低型hBMSCs进行茜素红染色、油红O染色、免疫荧光、RNA和蛋白的提取。qRT-PCR和Western-blotting分别检测成骨相关因子RUNX2,成脂相关因子PPAR-γ和C/EBP-α,FoxO信号通路基因FOXO1A、PCK2和PLK4以及PPAR信号通路基因FABP4、ADIPOQ、PLIN1和PLIN4的表达情况;免疫荧光技术辅助检测蛋白表达和定位。 结果:(1)hBMSCs成骨分化中，ZNF503敲低后有456个基因差异表达，并与FoxO信号通路、细胞周期和补体途径等有关，其中FoxO信号通路富集分数为1.60。体外实验中，在hBMSCs成骨分化第 16 d,相较于shNC组，shZNF503敲低组钙盐沉积增多，RUNX2蛋白表达增加。与野生型hBMSCs成骨分化第0d相比，FOXO1A和PCK2 mRNA和蛋白在第2d表达增加，并在第16 d表达最高(P＜0.01);相较于 shNC 组，shZNF503 敲低组 FOXO1A 和 PCK2 mRNA和蛋白表达在第16d显著增加(P＜0.05)且FOXO1A在细胞核表达明显。相反，PLK4 mRNA和蛋白在野生型hBMSCs成骨分化过程中表达减少(P＜0.05);相较于shNC组，shZNF503敲低组中PLK4 mRNA和蛋白表达在第16d显著下降(P＜0.05)。 (2)hBMSCs成脂分化过程中，ZNF503敲低后有416个基因差异表达，并与PPAR信号通路、Rap1信号通路和脂肪细胞脂化调节等有关，其中PPAR信号通路富集分数为-1.07。体外实验中，在hBMSCs成脂分化第16 d,相较于shNC组，shZNF503敲低组脂滴数明显减少，PPAR-γ和C/EBP-α蛋白表达明显减少。与野生型hBMSCs成脂分化第0 d相比，FABP4和ADIPOQ mRNA和蛋白在第8d表达明显上升，并在第16d最高（P＜0.01）;相较于shNC组，ZNF503敲低组FABP4和ADIPOQ mRNA和蛋白表达在第16 d显著减少（P＜0.05）且FABP4在细胞质的表达减少。相似的是，PLIN1和PLIN4 mRNA和蛋白在野生型hBMSCs成脂分化过程中表达增加（P＜0.05）;相较于 shNC 组，shZNF503 敲低组中 PLIN1 和 PLIN4 mRNA和蛋白表达在第16 d显著下降（P＜0.05）。 结论:（1）ZNF503敲低使得hBMSCs成骨分化中FoxO信号通路被激活，成脂分化中PPAR信号通路被抑制。 （2）ZNF503通过抑制FOXO1A,下调PCK2和上调PLK4的表达，从而抑制hBMSCs成骨分化，使得成骨细胞标志物RUNX2表达减少。 （3）ZNF503通过激活FABP4上调PPAR-γ的表达，从而促进hBMSCs成脂分化，使脂肪细胞标志物ADIPOQ、PLIN1和PLIN4表达增加。
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