摘要
文心兰(Oncidium)花型奇特，花色鲜艳，是世界上具有较高观赏价值的切花品种。文心兰属于呼吸跃变型花卉，内源乙烯的释放均会加速文心兰衰老从而降低鲜切花品质。茉莉酸是植物重要的内源激素，具有抑制衰老的作用。兰花授粉会引发花朵的衰老，文心兰的花药帽容易在采收和运输过程中脱落导致释放内源乙烯，使切花提前衰老，降低了其观赏价值。本研究以花药帽易落的‘柠檬绿’文心兰(Onc.hybridum‘Lemon Heart’)为实验材料，研究脱药帽和授粉处理对内源乙烯释放和茉莉酸含量的影响及与花朵衰老的关系；基于转录组测序和WGCNA分析找出影响文心兰花衰老的相关枢纽基因。分析相关枢纽基因在文心兰不同组织和花衰老过程中的表达规律，探究乙烯和茉莉酸对文心兰花衰老的调控机制；同时采用CRISPR/Cas9技术，初步进行编辑文心兰花衰老关键基因OhACO2的工作，探究获得瓶插寿命延长的文心兰切花的可能性。本文研究主要结果如下： 1、脱药帽、授粉处理文心兰花朵发现，授粉3天后唇瓣皱缩面积比为31.98％，进入衰老初期；授粉处理4d后唇瓣皱缩面积比为62.58%，花朵失去观赏价值；脱药帽处理6天后花朵唇瓣皱缩面积比达34.61%，花朵发生衰老，而未脱药帽对照花朵皱缩面积比为22.93%，说明授粉和脱药帽处理都会加速文心兰花朵衰老。与对照相比，授粉处理提前6天衰老，脱药帽处理花朵提前3天衰老。授粉处理后花朵含水量在衰老进程中都显著低于脱药帽，后者又明显低于未脱药帽处理。 2、通过测量脱药帽、授粉处理文心兰内源乙烯和茉莉酸含量发现，授粉处理8小时后，文心兰花朵内源乙烯迅速增加，蕊柱发生闭合，处理16小时后达到峰值，之后内源乙烯释放速率下降，到6天后达到另一峰值；脱药帽处理后16小时，检测到少量内源乙烯释放，处理3天后达到峰值。结果表明，脱药帽处理后会促进文心兰花朵释放大量乙烯，加速衰老。与授粉处理相比，脱药帽处理的内源乙烯高峰期比授粉处理延后且峰值低。对内源JA含量进行检测发现，脱药帽和授粉处理降低文心兰花内源JA含量。处理1天后，对照的内源JA含量最高，对照比脱药帽和授粉处理分别高57.86%和72.35%。结合不同花衰老进程的内源乙烯释放速率和内源JA含量规律表明，发现两者对文心兰花衰老可能存在相互拮抗作用，内源乙烯促进衰老；而JA延缓衰老。 3、通过对授粉、脱药帽和对照不同花衰老时期花部材料转录组数据进行WGCNA分析，挖掘出与文心兰内源乙烯和茉莉酸合成等相关的枢纽基因：乙烯生物合成关键基因OhACO1、OhACO2、OhACO3、OhACS1、OhACS2；脂氧合酶基因OhLOX1、OhLOX2；茉莉酸生物合成和信号传导相关基因OhAOC1、OhJAZ1和OhJAZ2。研究发现上述基因在不同器官、不同花部位和不同花衰老时期的表达量具有明显的时空表达差异性，表明这些基因与花衰老相关。其中，OhACO2在文心兰花中具有高表达量，且在蕊柱中的表达量最高，分别是OhACO1在蕊柱中表达量的79.86倍，OhACO3的117.03倍，OhACS1的390.10倍，OhACS2的248.24倍，且在衰老期表达量迅速升高。 4、通过MeJA及其抑制剂处理文心兰后乙烯合成关键基因表达情况发现，MeJA处理显著降低了乙烯生物合成关键基因OhACO1、OhACO2、OhACS2的表达量，而MeJA抑制剂处理不同程度的增加了它们的表达量。结果表明MeJA及其抑制剂处理影响了文心兰花朵乙烯生物合成相关基因的表达，进一步影响文心兰花朵衰老。 5、对脱药帽后的文心兰使用保鲜剂处理后发现，1-MCP和STS保鲜剂能显著延缓盛花期脱药帽处理的文心兰花朵衰老，增加切花瓶插观赏期。与对照相比，1-MCP和STS处理能显着提高文心兰花朵16小时后内源JA含量，且后续内源JA含量均比对照高，表明内源JA提高能延缓文心兰花朵衰老。 6、利用CRISPR/Cas9技术对文心兰OhACO2初步进行了基因编辑。以文心兰休眠芽为材料诱导出原球茎，获得良好的遗传转化受体材料，构建OhACO2的CAS9载体，使用农杆菌介导法获得PCR检测CAS9蛋白基因阳性的文心兰小苗，但经DNA测序发现目的基因未被编辑。
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