摘要
肉桂醛是一种植物精油。已有研究表明，添加肉桂醛会提高水生动物生产性能。水生动物的生长于其对营养物质的消化吸收密切相关。本研究首先通过生长试验考察肉桂醛对草鱼（Ctenopharyngodonidella）生长性能、肠道发育和肠道消化吸收能力以及肌肉品质的影响及可能机制；第二，考察饲粮肉桂醛对草鱼肌肉抗氧化能力的影响并在体外建立抗氧损伤模型，考察肉桂醛对草鱼抗氧化能力可能途径；第三，研究肉桂醛对草鱼肌肉发育及相关信号分子的影响，并通过体外试验，考察肉桂醛对成肌细胞增殖和分化以及细胞融合的影响。最后，根据生长性能指标，确定草鱼饲粮中肉桂醛的适宜添加水平，为草鱼饲料的配制提供依据。主要的研究内容和结果如下： 1.肉桂醛对草鱼生长性能、消化吸收和肌肉品质的影响 试验方法：选取450尾健康草鱼（227.29±0.46g），随机分为5个处理，每个处理3个重复。各处理组饲粮肉桂醛添加水平分别为：0、36、72、108、和144mg/kg。动物生长试验周期为60天。 研究结果发现：适宜水平的肉桂醛提高了草鱼的末重（FBW）、增重百分比（PWG）、特定生长率（SGR）、摄食量（FI）、饲料效率（FE）和蛋白质效率（PER）（Plt;0.05）；增加草鱼肠长、肠重、肠体指数和肠道皱襞高度（Plt;0.05）。以PWG为标识，利用二次回归模型，确定草鱼（227-878g）肉桂醛的适宜添加量为76.24mg/kg饲粮。适宜水平的肉桂醛提高草鱼肝胰脏和肠道中的胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，前、中、后肠Na+-K+-ATPase、AKP、γ-GT和CK的活力（Plt;0.05）。同时，适宜水平肉桂醛提高了前、中、后肠中性游离氨基酸Met（前肠除外）、Trp、Thr、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Gly、Pro、Ser、Tyr和Cys，碱性氨基酸Lys、Arg和His，酸性氨基酸Asp和Glu的含量（Plt;0.05）；提高了前、中、后肠碱性和中性氨基酸转运载体（AAT）SLC7A6、SLC7A7、SLC7A9（后肠除外）和SLC6A14，中性AATSLC1A5、SLC7A5、SLC7A8、SLC6A19和SLC38A2，碱性AATSLC7A1，酸性氨基酸转运载体SLC1A2a的mRNA表达（Plt;0.05）。进一步研究发现，适宜水平肉桂醛提高了前、中、后肠TOR和S6K1的mRNA表达（Plt;0.05），降低了4E-BP1的mRNA表达（Plt;0.05），提高前肠、中肠和后肠p-TOR蛋白表达（Plt;0.05）。以上结果表明，饲粮添加适宜水平的肉桂醛提高了草鱼肠道消化吸收能力，这可能与其提高肠道游离氨基酸含量，上调氨基酸转运体的mRNA表达以及激活TOR信号有关。适宜水平的肉桂醛增加了草鱼肌肉中肉桂醛的含量（Plt;0.05）；提高了草鱼肌肉中粗蛋白含量（Plt;0.05）。同时，适宜水平肉桂醛提高了草鱼肌肉羟脯氨酸、胶原蛋白含量和pH值（Plt;0.05），降低了草鱼肌肉剪切力、乳酸含量和蒸煮损失（Plt;0.05）；降低了草鱼肌肉甜味、苦味、令人愉快味道和不愉快味道的TAV值（Plt;0.05）。适宜水平的肉桂醛还提高了草鱼肌肉中EPA、DHA、n3、n6、∑PUFA和∑UFA含量（Plt;0.05），降低了∑SFA含量（Plt;0.05）。以上结果表明，肉桂醛能够促进草鱼生长、提高消化吸收能力并改善肌肉品质。 2.肉桂醛对草鱼肌肉抗氧化能力的影响 在试验一的基础上，我们发现肉桂醛改善了草鱼的肌肉品质，而肌肉品质与肌肉抗氧化能力密切相关。我的结果发现，适宜水平肉桂醛降低草鱼肌肉中ROS，PC和MDA含量（Plt;0.05），降低了SOD、GST和CAT酶活力以及GSH含量（Plt;0.05），降低了CuZnSOD、MnSOD、CAT、GR、Nrf2和Keap1b的mRNA表达以及核内Nrf2的蛋白表达（Plt;0.05）。通过测定体外抗氧化能力发现，随肉桂醛浓度增加对DPPH、·O2（ASA）、·OH（AHR）自由基的清除活性逐渐上升。表明肉桂醛可能通过自身抗氧化能力降低草鱼肌肉氧化损伤。 进一步建立体外氧化损伤模型，考察肉桂醛对草鱼原代成肌细胞抗氧化能力的影响。肉桂醛提高氧化损伤时成肌细胞活性（Plt;0.05），降低MDA和PC含量以及线粒体ROS产生（Plt;0.05），提高成肌细胞抗氧化酶活力（SOD、CAT和GPX）和GSH含量（Plt;0.05）以及抗氧化酶mRNA表达（CuZnSOD、MnSOD、CAT和GPX1a）（Plt;0.05），并提高了Nrf2的表达。以上结果表明，氧化损伤时肉桂醛可能通过提高草鱼肌肉抗氧化能力改善草鱼肌肉品质。 3.肉桂醛对草鱼肌纤维发育的影响及机制研究 3.1肉桂醛对草鱼肌纤维发育的影响 在试验一的基础上，我们发现肉桂醛改善了草鱼的肌肉品质，而肌肉品质与肌纤维的发育密切且相关。我们发现肉桂醛增加了草鱼肌纤维的直径（Plt;0.05），提高了gt;50μm直径肌纤维所占比例，适宜水平肉桂醛提高草鱼肌肉MyoG、MyoD和MYHC的mRNA表达和蛋白表达，降低了MSTN1的mRNA表达（Plt;0.05）；提高了TOR和S6K1的mRNA表达，p-TOR、p-S6K1和p-4E-BP1的蛋白表达以及p-S6K1/T-S6K1和p-4E-BP1/T-4E-BP1的比值，降低了4E-BP1的mRNA表达（Plt;0.05）。同时，适宜水平肉桂醛降低了CAPN、ATG5、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、MAFBX、UB和FOXO3a的mRNA表达以及UB蛋白表达（Plt;0.05）；提高了CAST、IGF-1、PI3K和AKT的mRNA表达，降低PTP1B的mRNA表达和PTP1B的蛋白表达，提高AKT的蛋白表达（Plt;0.05）。肉桂醛对草鱼肌肉Myomaker和Myomixer表达没有显著影响（Pgt;0.05）。以上结果表明，饲粮适宜水平的肉桂醛改善草鱼肌肉品质可能与其促进肌纤维发育有关。为进一步研究肉桂醛促进草鱼肌纤维发育的机制，我们开展了体外研究。 3.2肉桂醛对草鱼原代成肌细胞增殖和分化的影响 草鱼原代成肌细胞为研究对象，设定5个处理组（0、5、10、15和20μM肉桂醛），每个处理组6个重复。结果发现，10μM肉桂醛提高了细胞活性、成肌细胞数量以及EDU+细胞的数量（Plt;0.05），因此以10μM肉桂醛为后续试验剂量。进一步研究发现，肉桂醛上调了细胞周期蛋白CyclinB、CyclinD和信号分子E2F4的mRNA表达（Plt;0.05）。草鱼原代成肌细胞经过分化处理，经免疫荧光鉴定，得到的肌管为研究对象，设定5个处理组（0、5、10、15和20μM肉桂醛），每个处理组6个重复。结果发现，添加10μM肉桂醛，提高了肌管的长度和直径，提高了肌酸激酶的活性（Plt;0.05）。 3.3肉桂醛对草鱼蛋白质沉积相关信号的影响 （1）设计2个处理，分别为DMSO组和CIN组，每个处理6个重复。结果发现：与DMSO组相比，CIN组降低肌管PTP1B的mRNA表达和蛋白表达，提高了IGF-1的mRNA表达（Plt;0.05）。（2）设计4个处理，分别为DMSO组、CIN组、Rapa组和CIN+Rapa组，每个处理6个重复。结果发现：与Rapa组相比，CIN+Rapa组上调了MyoG和MYHC的mRNA表达和蛋白表达，上调了TOR和S6K1的mRNA水平，提高了p-TOR和T-TOR蛋白表达（Plt;0.05）。（3）设计4个处理，分别为DMSO组、CIN组、Wort组和CIN+Wort组，每个处理6个重复。结果发现：与Wort组相比，CIN+Wort组提高了MyoG和MYHC的mRNA表达和蛋白表达，降低了肌管FOXO3a的mRNA表达，上调了肌管AKT的mRNA表达（Plt;0.05）。以上结果表明肉桂醛通过调控TOR和FOXO3a信号促进蛋白质沉积。 3.4肉桂醛对草鱼成肌细胞融合的影响 （1）共设计4个处理，分别为DMSO组、CIN组、siMyoG组和CIN+siMyoG组，每个处理6个重复。结果发现：与siMyoG组相比，CIN+siMyoG组增加了肌管细胞细胞核数量ngt;1所占的比例，上调了肌管细胞MyoG和MYHC的mRNA表达和蛋白表达，上调了肌管细胞Myomaker和Myomixer的mRNA表达（Plt;0.05）。（2）共设计4个处理，分别为DMSO组、CIN组、Decorin组和CIN+Decorin组，每个处理6个重复。结果发现：与Decorin组相比，CIN+Decorin组对肌管细胞细胞核数量ngt;1所占的比例没有影响，对肌管细胞MyoG和MYHC的mRNA表达及MyoG、MYHC和p-Smad2和T-Smad2蛋白表达没有影响，对肌管细胞Myomaker和Myomixer的mRNA表达没有影响（Pgt;0.05）。（3）共设计4个处理，分别为DMSO组、CIN组、LiCl组和CIN+LiCl组，每个处理6个重复。结果发现：与LiCl组相比，CIN+LiCl组提高了肌管细胞细胞核数量ngt;1所占的比例，上调了MyoG和MYHC的mRNA表达和蛋白表达，上调了Myomaker和Myomixer的mRNA表达（Plt;0.05）。以上结果表明，肉桂醛能够通过GSK3-β信号调控MyoG促进鱼类成肌细胞的融合。 综上所述，肉桂醛提高了草鱼生长与肠道消化吸收能力可能与肉桂醛促进TOR信号途径上调肠道游离氨基酸含量和氨基酸转运载体的mRNA表达有关；肉桂醛改善了草鱼肌肉营养品质、感官品质、保健品质和风味品质。肉桂醛改善了草鱼肌肉品质可能与肉桂醛提高草鱼肌肉抗氧化能力和促进肌纤维发育有关。肉桂醛促进肌纤维发育可能是通过促进成肌细胞增殖和分化，并且通过TOR信号和FOXO3a信号促进蛋白质沉积与通过GSK3-β信号（不是TGF-β信号）而调控MyoG从而促进成肌细胞的融合有关。
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