摘要
猪德尔塔冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus,PDCoV）是近几年流行的一种猪肠道性致病性病毒，会引起仔猪呕吐，脱水，腹泻等症状，并且已在全世界范围内流行，给全球养猪业造成了巨大的影响和经济损失。病毒在感染过程中，会通过诱导细胞凋亡来促进自身复制和扩散，有研究表明PDCoV会在体内外诱导组织和细胞的凋亡。硒具有调节免疫、抗炎等多种活性作用；硒可通过拮抗一些毒物诱导的细胞凋亡来缓解其毒性作用，那么硒能否通过抑制PDCoV诱导的凋亡来发挥抗病毒作用是值得关注的一点。因此，本试验通过体外培养猪睾丸细胞（Swinetestis,ST），探讨PDCoV体外诱导ST细胞凋亡及凋亡蛋白的变化，再加入纳米硒检测病毒复制量、凋亡率及凋亡蛋白的变化，探究纳米硒对PDCoV的抑制作用，为抗PDCoV的药物研发和临床用药提供理论依据。具体试验内容和结果如下： 1.PDCoV在ST细胞培养中胰酶浓度和生长特性的研究 首先探究胰蛋白酶对PDCoV感染ST细胞的影响。采用CCK-8法检测不同浓度的胰蛋白酶对ST细胞毒性的影响，结果表明4μg/mL是胰酶的最大无毒浓度。随后在病毒孵育后分别加入含1，2，3，4μg/mL胰酶的培养液，培养48h后通过qPCR和IFA检测PDCoV在细胞内的复制量及感染情况。结果表明，不添加胰酶时未检测到细胞内有病毒，添加胰酶后病毒复制量及感染细胞数量随胰酶浓度增加而升高，表明添加胰酶是PDCoV感染ST细胞的关键条件，确定4μg/mL胰酶是病毒的感染和增殖的最佳浓度。然后观察了PDCoV感染后ST细胞的病变，结果发现细胞边缘变得细长，形态无规则，细胞中出现空泡，部分细胞变圆、聚集并脱落。最后以10倍稀释梯度将病毒从10-1稀释至10-8并分别感染细胞，连续观察记录每个病毒稀释度组的细胞病变情况，观察至空白组细胞衰老脱落，通过Reed-Muench法计算得出PDCoV对ST细胞的TCID50为10-5.7/0.1mL。 2.PDCoV感染对ST细胞凋亡的影响 使用流式细胞术检测PDCoV感染后细胞凋亡率的变化，结果显示PDCoV感染组与Control组相比细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均有增加，尤其是在感染后24h和48h。随后通过WB法检测了细胞质中CytC、活化的Caspase9和Caspase3蛋白表达量，结果表明与Control组相比，PDCoV感染组三个蛋白表达量均有显著增加（P＜0.01），且蛋白表达量在一定范围内随时间增加而增多。表明PDCoV感染导致了CytC从线粒体的释放，进而激活了Caspase9和Caspase3。使用JC-1染料法检测PDCoV感染后细胞线粒体膜电位的变化，结果显示PDCoV感染组与Control组相比膜电位没有显著变化。采用qPCR和WB法检测线粒体动力学蛋白的mRNA和蛋白表达量变化，结果显示PDCoV感染后会引起线粒体的分裂增加、融合减少。 3.纳米硒抗病毒作用及拮抗细胞凋亡作用研究 首先进行肉桂醛，百里香酚及纳米硒抗PDCoV药物的筛选，前期试验测得三种药物的最大无毒浓度分别为2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL，根据该结果分别对三个药物设置低、中、高浓度，分别处理感染PDCoV的ST细胞6h，24h和48h后，采用qPCR法检测病毒M基因复制量，结果表明三种药物对PDCoV的复制均有一定的抑制作用，但纳米硒的抑制作用最明显，其中4μg/mL纳米硒是最佳抗病毒浓度。 用4μg/mL纳米硒处理感染细胞6h，24h和48h后，采用流式细胞术检测不同组的细胞凋亡率。结果显示在24h和48h，SeNPs组与Control组没有显著差异（P＞0.05），PDCoV+SeNPs组显著降低了晚期凋亡率和总凋亡率（P＜0.05或0.01），表明纳米硒可抑制PDCoV诱导的细胞凋亡。采用WB法检测凋亡相关蛋白的表达量，结果显示SeNPs组与Control组比较，CytC和Caspase9表达量没有显著差异（P＞0.05），Caspase3在48h时SeNPs组高于Control组（P＜0.01），PDCoV+SeNPs组的三个凋亡蛋白表达量均极显著高于PDCoV组（P＜0.01）。 结论：（1）添加胰蛋白酶是PDCoV体外感染ST细胞和在其中增殖的关键条件，感染PDCoV的细胞出现边缘拉长，形态无规则，出现空泡，部分细胞变圆聚集并脱落等病变；PDCoV对ST细胞的TCID50为10-5.7/0.1mL。（2）PDCoV感染会促进线粒体释放CytC和活化Caspase9、Caspase3蛋白从而诱导细胞凋亡；PDCoV感染引起线粒体的过度分裂。（3）在肉桂醛，百里香酚及纳米硒三种药物中，纳米硒体外抗PDCoV的作用最明显，且4μg/mL为SeNPs的最佳抗病毒浓度；纳米硒通过减少CytC的释放和Caspase9、Caspase3的表达量从而抑制了PDCoV诱导的细胞凋亡。
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