桑花叶型萎缩病三种相关病原分子检测技术的研究

扫码查看

原文链接

NETL

中文摘要：桑花叶型萎缩病是一种重要的桑树病害，在各地桑园均有发生。桑花叶型萎缩病的相关病原主要有3种：桑花叶型萎缩病相关病毒（Mulberry mosaic dwarf associated virus,MMDaV）、桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding associated virus,MVBaV）和桑植原体（Candidatus Phytoplasma asteris MD,Ca.P.asteris MD）。对这3种相关病原进行检测是对桑花叶型萎缩病进行防控的前提。本研究收集了自2019至2021年间全国8个省共329份桑花叶型萎缩病疑似病样，通过对样本中三种主要相关病原MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD的PCR检测，尝试查明不同时期导致桑花叶型萎缩病的3种相关病原的感染情况；进而应用全基因组测序和生物信息学方法对桑植原体Ca.P.asteris MD进行了全基因组测序和分析；并在对两种病原MMDaV和Ca.P.asteris MD的全基因组信息进行系统发育分析的基础上，构建了阳性克隆质粒，并建立桑花叶型萎缩病三种病原的分子检测技术和方法。主要结果如下：（1）对桑花叶型萎缩病疑似病样中3种相关病原MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD的PCR检测结果为，单一检出率分别为33.74%，25.19%，26.14%，MMDaV+Ca.P.asteris MD检出率为6.08%，MMDaV+MVBaV检出率为14.94%，Ca.P.asteris MD+MVBaV检出率为3.45%，MMDaV+MVBaV+Ca.P.asteris MD检出率为4.60%。结果显示桑花叶型萎缩病存在3种相关病原混合感染现象，既有2种病原混染，也有单一病原感染。（2）桑植原体Ca.P.asteris MDGZ-01基因组学重测序组装分析获得全序列大小为622358bp，GC含量为29.1%，含有32个tRNA，4个rRNA，634个CDS，注释到246个假定蛋白和388个具有功能分配的蛋白质，9种子系统，14个耐药基因，并对其中6个耐药基因进行了PCR及测序验证。（3）对30株不同来源MMDaV的系统发育分析结果显示，桑花叶型萎缩病MMDaV与桑树皱叶病毒（MCLV）处在同一支，同源性为95%，应将MMDaV归为双生病毒科Mulcrilevirus属不同株系。（4）成功构建了MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD3种病原5个阳性克隆质粒，分别是MMDaV的全基因序列质粒pEASY-MMDaV-QC、包含V2、V3和外壳蛋白基因CP的pMD19T-MMDaV-F3，MVBaV的pEASY-MVBaV-N、pEASY-MVBaV-NSs，桑植原体的pEASY-ltrA，上述5个阳性克隆质粒均可作为分子检测的阳性对照。（5）成功建立了MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD的多重PCR检测技术。基于MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD的外壳蛋白基因CP、非结构性RNA沉默抑制蛋白基因NSs、第二类内含子编码蛋白基因ltrA建立的多重PCR检测方法的灵敏度分别为105、104、105copies/μL，该检测技术仍待完善。（6）成功研制了MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD的等温多自配引发扩增技术（IMSA）和初试产品。分别基于MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD的CP、NSs、ltrA基因构建的IMSA检测灵敏度分别为3×103、2×103、400copies/μL。组装的MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD的IMSA检测试剂盒测试结果与PCR的阳性一致性分别为36.43%、34.72%、32.16%。综上，本研究探究了不同时期桑花叶型萎缩病3种相关病原的感染情况，重测序组装了桑植原体Ca.P.asteris MDGZ-01全基因组完整序列，初步建立了桑花叶型萎缩病三种相关病原的多重PCR检测方法，同时研制了三种相关病原的IMSA检测技术和产品作为补充。研究结果将为桑病毒病及植原体病的检测及防控提供理论和技术参考。

作者：

孟芳

展开 >

关键词：

桑花叶型萎缩病病原检测全基因组测序生物信息学

授予学位：

硕士

学科专业：

畜牧

导师：

刘吉平、戴凡炜

学位年度：

2022

学位授予单位：

华南农业大学

语种：

中文

中图分类号：