摘要
氮磷是植物生长必需的大量元素，也是“肥料三要素”的主要组成部分。所以，提高作物氮磷协同高效吸收和利用，是保障我国农业生产中“减肥增效”的措施。虽然，以往的研究表明模式植物(拟南芥和水稻)中存在氮磷协同高效的分子调控机制。但是，对于氮磷协同信号通路中的蛋白是否可以通过磷酸化过程来参与氮磷的吸收利用鲜有报道。本研究利用水培体系分析了低磷对大豆生长的影响，并结合同位素标记相对定量技术(iTRAQ)和质谱分析技术，鉴定了不同磷处理下大豆根系参与氮代谢过程的差异磷酸化蛋白。其中，发现硝酸还原酶蛋白GmNR4的磷酸化水平受低磷胁迫显著提高。在此基础上，进一步对大豆基因组中的4个GmNR家族成员进行生物信息学分析和表达模式分析。最后，选取GmNR4为候选基因，进一步分析了GmNR4亚细胞定位、GmNR4磷酸化修饰对硝酸还原酶活性的影响以及GmNR4的生物学功能。主要研究结果如下： 1.通过iTRAQ和质谱分析技术，在大豆根系中共鉴定到2088个磷酸化蛋白，其中响应低磷胁迫的差异磷酸化蛋白有451个。在鉴定到的所有磷酸化蛋白中，有24个蛋白参与氮代谢过程；并发现硝酸还原酶蛋白GmNR4在低磷处理条件下其磷酸化水平显著提高了1.6倍，GmNR4存在磷酸化修饰的位点是位于蛋白第491位的丝氨酸。 2.在大豆基因组中，GmNR家族具有4个成员，分别命名为GmNR1、GmNR2、GmNR3和GmNR4。通过qRT-PCR分析，结果显示，GmNR1、GmNR2和GmNR4在叶部和根系的表达模式受到外源磷有效性的调控，GmNR3在大豆叶部和根系均不表达。其中，低磷处理显著提高GmNR4在大豆根系的基因表达量；但低磷处理仅显著提高12天根系中GmNR1和4天和8天根系中GmNR2的基因表达量。与根部的表达模式不同，低磷处理仅显著提高12天老叶中GmNR4的表达量；另外，在低磷处理4天时，GmNR1和GmNR2的表达量下降，而到第8天时，GmNR1和GmNR2的表达量显著提高。 3.以GmNR4为进一步研究对象，通过烟草表皮细胞瞬时表达体系分析其亚细胞定位。结果显示，GmNR4定位于细胞质、细胞膜和细胞核。另外，通过大肠杆菌异源表达系统，纯化了GmNR4及其磷酸化修饰位点定点突变融合GST的蛋白。蛋白酶活分析表明，与GST-GmNR4相比，非磷酸化突变(GST-GmR4S491A)显著提高其酶活性。但是，当该磷酸化位点突变为磷酸化状态(GST-GmR4S491D)时，其酶活性显著降低，说明了GmNR4的酶活性受其磷酸化水平的调控。 4.通过大豆离体毛根转化法，分别比较了超量表达GmNR4或敲除GmNR4对大豆离体毛根生长和氮磷浓度的影响。结果显示，敲除GmNR4显著降低了大豆离体毛根鲜重和全氮含量。另外，在正常磷条件下，超量表达GmNR4显著降低了大豆离体毛根磷浓度，敲除GmNR4则显著提高了大豆毛根的磷浓度。 综上所述，本研究通过蛋白磷酸化组学分析和qRT-PCR分析，筛选出在根系受低磷处理蛋白磷酸化水平和基因表达水平提高的硝酸还原酶基因GmNR4。并通过在大豆毛根中超量或敲除GmNR4初步明确了GmNR4参与调控大豆离体毛根生长和氮吸收效率的生物学功能，该研究结果为进一步解析作物氮磷协同高效的分子机制提供了理论依据。
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