摘要
迪基氏菌（Dickeya）和果胶软腐杆菌（Pectobacterium）是最典型、危害最严重的软腐细菌，其中，由Dickeya引起的水稻细菌性基腐病、香蕉细菌性软腐病、芋头细菌性软腐病等已成为近几年农业生产的重大威胁。目前对细菌性软腐病的防治主要采用铜制剂和抗生素类杀菌剂，此类试剂通常以影响细菌的生长和生存为目标，长期使用导致了菌株耐药性的增加，因此，寻找以细菌的毒力因子为作用靶标而不影响其生长和存活的新型化合物成为防治病原菌的新策略。T3SS（Type III Secretion System）是许多革兰氏阴性病原细菌的主要毒力因子，是抗菌药物筛选的一个有吸引力的靶标。本研究以T3SS为作用靶标，利用hrpA-gfp报告系统筛选到五种对D.zeae MS2T3SS的功能有抑制作用的植物天然产物，探讨了它们的抑制机理，并证明其抑制Dickeya软腐菌对寄主植物的致病力，为预防由Dickeya引起的软腐病提供了潜在的天然、安全和有效的植物源生防制剂。具体研究结果如下： （1）筛选到五种T3SS抑制剂：将D.zeae MS2T3SS编码三型菌毛基因hrpA的启动子插入到质粒pPROBE-NT的gfp标签前端，构建T3SS报告系统MS2(pPhrpA-gfp)；在hrp诱导培养基LS5中添加化合物处理细菌细胞，利用多功能酶标仪初筛和流式细胞仪复筛以确定抑制hrpA启动子活性的化合物。结果显示，水杨酸（SA）、对羟基苯甲酸（PHBA）、肉桂醇（CA）、对香豆酸（PCA）和3-苯丙酸（HA）五种植物天然化合物对hrpA启动子活性具有明显的抑制作用，且对细菌的各生长阶段生长都没有影响，用这五种化合物处理后非寄主烟草叶片上的过敏性反应（hypersensitive response,HR）也受到不同程度的减弱。上述结果说明，五种植物天然产物可抑制T3SS的功能而不影响MS2的生长。 （2）初步明确了五种T3SS抑制剂的作用机理：利用RT-qPCR测定T3SS编码基因簇（dsp/hrp/hrc基因簇）中一些关键基因的相对转录水平，结果显示，五种化合物均下调了T3SS主调控基因hrpL的表达。对HrpL上游调控通路基因进行表达量差异分析，初步明确了五种植物天然产物SA、PHBA、CA、PCA和HA抑制D.zeae MS2T3SS表达的调控路径：SA通过HrpX/HrpY-HrpS-RpoN和GacS/GacA-rsmB-RsmA途径降低T3SS基因的表达水平；PHBA作用于GacS抑制hrpL转录；CA作用于HrpS和GacA抑制hrpL的转录；PCA通过HrpS和GacS/GacA途径抑制hrpL转录；HA除了对hrpN、hrcC和hrpY表达没有影响外，其调控模式与PCA的相似。 （3）在Dickeya细菌中首次发现GacA正调控rpoN的转录：利用同源重组原理敲除基因gacA得到敲除突变体。RT-qPCR结果表明，ΔgacA突变体中，rpoN的表达量降低了1.96倍，hrpL的转录水平下调了4.2倍，表明GacA正调控rpoN和hrpL的转录。 （4）五种T3SS抑制剂显著降低作物细菌性软腐病的发生：利用上述五种化合物进行几种不同的细菌性软腐病抑制效果测定，结果表明，五种化合物均能显著减轻D.dadantii3937对马铃薯、D.fangzhongdai CL3对芋头、D.oryzae EC1对水稻和D.zeae MS2对香蕉的软腐病症状。 综上，本研究鉴定了五种植物天然产物SA、PHBA、CA、PCA和HA可作为T3SS抑制剂，初步明确了它们抑制T3SS功能的作用途径，并证明其抑制Dickeya软腐菌对寄主植物的致病力。表明这五种植物天然产物在病原-寄主互作中发挥了重要作用，具有作为天然、安全和有效的植物源生防制剂用于治疗由Dickeya引起的植物病害的潜力。
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