摘要
目的: 淋巴瘤是一组异质性的血液免疫系统的恶性肿瘤，分为霍奇金(HL)和非霍奇金(NHL)两种亚型。CD30是一种细胞表面受体，它在某些造血恶性肿瘤，如间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)以及弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)等多种淋巴瘤中高表达，CD30已被认为是一种重要的诊断标记物和潜在的治疗靶点。 嵌合抗原受体T细胞( CAR-T)是经过基因改造，在其表面表达合成CAR分子的T淋巴细胞。CAR分子赋予T淋巴细胞识别细胞表面靶抗原的能力，并对表达这些抗原的细胞介导特异性细胞毒性。通常，CARs的抗原靶向结构域是单克隆抗体的单链抗体片段(scFv)。然而，单链抗体作为CAR靶向结构域的具有一定的局限性。许多研究结果证实，在临床前和临床环境中，基于纳米抗体的CAR-Ts可以与基于单链抗体的CAR-Ts发挥同样的功能。基于纳米抗体的低免疫原性、稳定性、特异性和高亲和力，作为替代单链抗体的CAR靶向结构域,我们可以筛选特异性靶向肿瘤细胞纳米抗体序列，用于CAR-T细胞的改造。 方法: 使用CD30抗原蛋白免疫羊驼，经过免疫后，分离外周血单核细胞，提取RNA,通过巢式PCR利用驼类单域抗体特异性引物YF,YR获取纳米抗体目的基因;设计噬菌体展示质粒pHEN6,用分子生物学方法构建噬菌粒，使用电击转化法将噬菌体粒转入大肠杆菌TG1中即为免疫CD30的大肠杆菌库;利用辅助噬菌体M13K07超染大肠杆菌，在辅助噬菌体的帮助下启动滚筒式复制，以此构建CD30疫的噬菌体展示纳米抗体基因库;用酶联免疫吸附法进行2-3轮的噬菌体库固相淘洗，以得到表达特异性CD30抗体的噬菌体，重新感染大肠杆菌涂板获取单菌落进行噬菌体ELISA筛选得到阳性克隆，测序获取特异性抗体核酸序列;核酸序列经过遗传学分析剔除高重复度的序列，对表达遗传变异度高的序列进行功能验证，包括亲和力测试和CD30阳性细胞ELISA试验等验证抗体亲和力和特异性。 结果: 构建了 CD30免疫的噬菌体展示纳米抗体基因库，共分离得到53个VHH克隆株。用DNAstar软件对53个VHH克隆株基因蛋白进行基因进化树分析后，选择4个高遗传变异度的VHH克隆在大肠杆菌中进行原核表达和蛋白纯化，使用间接ELISA法测定纳米抗体的亲和活性，4株纳米抗体的抗体亲和活性均高。使用CD30阳性细胞ELISA法检测使用BLI生物膜干涉技术测试抗体与抗原之间的特异性相互作用，4株纳米抗体对CD30抗原具有较强的结合能力，且亲和力值均在纳摩尔水平。 结论: 基于噬菌体展示平台，可以构建高容量的CD30-VHH库，筛选出4株较高亲和力的特异性结合CD30抗原的纳米抗体，这些靶向CD30的纳米抗体为进一步研发替代单链抗体的CAR靶向结构域的CAR-T细胞免疫治疗以及研发新纳米抗体药物和双特异性纳米抗体提供支持。
NETL