摘要
液滴微流控技术能够在微米尺度通道内进行流体控制以生成所需液滴，可以精确调控液滴的内容物构成、尺寸及生成频率等参数。通过设计芯片结构和集成外部控制部件，对生成的液滴进一步操控以满足不同研究和应用场景的需求。将生物活细胞包载到液滴中可以构建载细胞液滴，液滴固化后形成的凝胶微球能够充当细胞的微米级培养单元和独立的微反应器。这种载细胞凝胶微球在细胞生物学基础研究和药物分析等领域具有广泛的应用价值。 基于微流控技术的载细胞凝胶微球制备方法具有在单一或者少数细胞的大批量对比分析上的突出优势，得到了相关研究人员越来越多的关注。然而，现有研究中载细胞凝胶微球制备和细胞培养过程基本都是分离的，需要将制备得到的载细胞凝胶微球从制备装置中洗脱、分离后转移至常规细胞培养皿或孔板中进行细胞培养。凝胶微球在不同器材间的转移容易造成无菌环境的破坏，常规细胞培养方式会消耗过多试剂，将大量载细胞凝胶微球堆叠在培养皿中长期培养还容易发生凝胶微球变形或融合，不利于单细胞观察和分析。 为解决这些问题，本文设计了一款新的集成微流控芯片，可以将液滴生成、液滴凝胶固化、凝胶微球捕获、基于凝胶微球的细胞培养分析等功能全部集成在单一芯片中，实现单一或少量细胞的长期稳定培养及观察。集成和封闭的微球制备和细胞三维培养系统可以避免细胞转移带来的污染风险，多功能集成芯片设计也有助于实现细胞多个分析流程的自动化进行，减少试剂消耗和样品投入，节省时间。本文的主要研究工作如下： 根据集成化的芯片设计思想，设计了用于凝胶微球制备，微球捕获固定及细胞培养的两个主要功能模块和连接流路。在芯片设计及仿真优化基础上，选择具有良好透气性和可加工性的聚二甲基硅氧烷作为基本材料构建了芯片结构模块，并针对载细胞微球制备和微球固定和细胞培养等功能实现展开研究分析。 在载细胞微球制备研究中，选择生物相容性更好的氟化油作为凝胶微球制备实验的油相，利用更温和的海藻酸钠-钙离子凝胶体系，将钙离子预先螯合在海藻酸钠预聚液中，液滴生成后在酸性条件下释放钙离子触发液滴固化得到凝胶化的均匀微球。通过实验分析，优化了微芯片通道宽度、两液相成分配比及进样流量、海藻酸预聚液中的细胞密度等相关参数，实现了微通道中载细胞凝胶微球生成过程的精确操控。在优化的条件下，人髓原白血病细胞（K562）的单细胞包封率可以达到33.8%?1.8%，包载细胞存活率gt;95%，粒径均一性CV为3.85%。 针对大量载细胞凝胶微球同时定位和细胞培养的要求，设计了包含286个独立的细胞培养隔室的阵列化微球捕获结构模块。通过仿真和实验研究，实现了微球捕获固定和细胞培养等相关功能并开展了相关参数的优化分析。基于不同模块的集成和流动操控条件的设定，在集成芯片上实现了载细胞凝胶微球制备、固定和细胞培养的依次操作。初步的细胞培养实验证实了包封在凝胶微球内的细胞可以保持较好的细胞形态，在培养24h后细胞存活率大于95%。 综上所述，本研究按集成化芯片设计思想构建了一套具有较高生物相容性的载细胞凝胶微球制备及细胞原位培养体系，可以为组织工程研究与应用、细胞分析等领域提供一种有力的工具。
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