摘要
目的：松花粉具有保护器官、调节代谢、增强免疫力等药理作用，但松花粉抗肿瘤作用及机制的研究仍不透彻。本研究通过观察松花粉对人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞增殖、凋亡、细胞周期和自噬的影响，进一步探讨松花粉抗肝癌作用及其机制，为松花粉的临床应用提供理论和实验依据。 方法：体外培养人肝癌SK-Hep-1细胞，随机分为4组，分别为对照组（0mg/mL松花粉）、实验组(30、45、60mg/mL松花粉)。（1）采用细胞增殖/毒性检测试剂盒CCK-8，检测不同浓度松花粉干预不同时间（12、24、48和72h）后的SK-Hep-1细胞抑制率；（2）松花粉作用2w后，平板克隆实验观察松花粉对SK-Hep-1细胞克隆、增殖的影响；（3）松花粉处理48h后，倒置相差显微镜观察松花粉干预后的SK-Hep-1细胞形态学变化；（4）Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡的形态学变化和AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术观察细胞凋亡的情况；（5）流式细胞仪检测SK-Hep-1细胞的细胞周期变化；（6）RT-PCR方法检测自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62mRNA的表达水平，Westernblot法检测自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的蛋白表达水平；（7）数据处理采用SPSS23.0统计软件，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用one-wayANOVA或非参数检验进行比较，以P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果：（1）CCK-8法检测显示，松花粉能明显抑制SK-Hep-1细胞增殖，并具有时间和剂量依赖性；（2）平板克隆实验显示，随着松花粉浓度的增高，细胞形成集落数量减少；（3）倒置相差显微镜显示，松花粉可以抑制细胞的增殖；（4）Hoechst33258荧光染色显示，松花粉可以促进细胞凋亡；AnnexinV-FITC/PI双染法显示，与对照组比较，松花粉不同浓度组干预后细胞凋亡率明显升高（P＜0.05或P＜0.01），并且细胞凋亡率随着药物作用浓度的增高而增加；（5）细胞周期实验显示，松花粉能使SK-Hep-1细胞周期阻滞于G1期，同时S期和G2期的细胞比例也下降；（6）RT-PCR分析显示，经松花粉(30、45、60mg/mL）处理后，Beclin-1、LC3-Ⅱ的mRNA表达较对照组明显增加（P＜0.05或P＜0.01），而P62的mRNA表达较对照组降低（P＜0.05或P＜0.01）；Westernblot法检测自噬相关基因蛋白的表达水平，也同样得出相同的结论。这进一步证明了松花粉对人肝癌SK-Hep-1细胞具有促进自噬的作用。 结论：（1）松花粉能明显降低人肝癌SK-Hep-1细胞增殖能力，且呈剂量和时间依赖性；松花粉能促进细胞的凋亡并使细胞阻滞于细胞周期G1期。（2）松花粉可使人肝癌SK-Hep-1细胞中自噬增强，促进人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞的自噬作用，其机制可能是通过提高人肝癌SK-Hep-1细胞Beclin-1、LC3-Ⅱ表达，降低SK-Hep-1细胞P62表达，通过诱导自噬从而发挥抗肝癌的作用。
NETL