摘要
中国大鲵是我国特有的两栖类物种，目前对其性别相关分子研究主要集中于性别分化后，而性别决定和分化关键期的研究仍处于空白。因此，本研究通过性类固醇激素诱导大鲵性逆转，并制作自然组和激素组大鲵性腺切片作为表型数据。在此基础上，选取了中国大鲵已发现的性别相关基因（Sox3、Foxl2、Dmrt1、Sox9、Cyp19a），初步探讨影响其性别决定和性腺发育的分子机制。同时选取Sox3、Foxl2及Dmrt1基因，分析其启动子区潜在的调控通路，并从表观遗传学水平研究了中国大鲵Sox3、Foxl2及Dmrt1基因启动子区CpG岛甲基化水平与基因表达差异的关系，以期为阐明两栖动物的调控网络和调控机制提供一定参考依据。相关研究结果如下： 1．切片表型结果：苯甲酸雌二醇（EB）可以诱导中国大鲵遗传雄性逆转为雌性，但需要外源激素维持到原始卵泡初步分化后，过早的停止外源激素会导致卵母细胞分化的停滞，出现一种结构分化明显而缺少卵母细胞和原始卵泡的空心卵巢结构。17α-甲基睾酮（MT）不能引起遗传雌性的性逆转，但可以诱导遗传雄性产生原始卵泡和卵巢腔等雌性特征。 2．性别分化相关基因的表达模式结果：Sox3在遗传雌性卵巢分化过程中表达量显著上调，与遗传雄性差异显著，结合切片结果推测，其表达上调可能与中国大鲵的原始卵泡和卵母细胞的分化有关。而Foxl2在雌雄性腺中的表达趋势一致，推测其在分化早期的肾脏中高表达，此外，雌激素能诱导Foxl2表达显著上调。在对照组遗传雄性中，Dmrt1从7月龄开始表达显著上调并维持高表达，此时还未见明显的精巢结构分化，表明Dmrt1在雄性性别决定过程中具有重要作用，此外，所有遗传雌性的Dmrt1在7/8月龄都出现显著上调，推测其在卵巢发育中可能也有一定作用。Sox9和Cyp19a都表现出偏雌性表达，遗传雌性中Sox9在8~10月龄表达明显高于前期，切片结构显示此时卵母细胞基本完成分化，推测Sox9可能与卵母细胞的发生与维持有关；而Cyp19a表达上调在切片观察到原始卵泡和卵母细胞前，可能与早期卵巢的分化有关。 3．启动子克隆和CpG岛的甲基化分析结果：分别获得中国大鲵Sox3、Foxl2及Dmrt1基因启动子端序列2029bp、3004bp和2459bp。顺式元件分析结果显示，三个基因启动子区都预测到转录激活蛋白AP-1、特化蛋白Sp1、核因子NF-1、八聚体结合蛋白Oct-1等蛋白结合位点，此外，性别相关的SRY、ER、GR和E2等结合位点也分别在3个基因的启动子区被预测到。甲基化检测结果显示，Sox3启动子区存在1个CpG岛，在精巢和卵巢中都是完全未甲基化的，CpG岛甲基化水平跟组织差异表达量不相关；Foxl2启动子区存在6个CpG岛，其中CpGI2和CpGI6在精巢和卵巢中都呈低甲基化，而CpGI5在精巢和卵巢中呈全未甲基化，甲基化与Foxl2的表达未见相关性；Dmrt1基因的启动子区存在1个CpG岛，在精巢和卵巢中都呈高甲基化的，但与表达呈现负相关性。
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