摘要
目的： 帕金森病（PD）发病机制复杂，神经元受损及α-突触核蛋白（α-syn）异常堆积是其明显的病理表现。目前有研究认为线粒体功能障碍是PD发病的机制之一，维持和保护损伤线粒体功能是PD治疗的一种策略。 本研究发现了一种来源于刺参的新多肽，通过H2O2和MPTP诱导线粒体损伤的细胞模型和MPTP诱导PD样病变的动物模型，研究新多肽保护细胞线粒体减轻MPTP诱导神经损伤功能及相关机制，并试图为海洋生物多肽资源开发应用于衰老相关疾病治疗提供新思路。 方法： 细胞实验：（1）在前期筛选基础上选择两种多肽P1和P2处理细胞，再使用H2O2（600μM）处理SH-SY5Y构建氧化损伤模型，MTT法检测不同组细胞的存活率。流式细胞术检测细胞内活性氧水平、细胞周期分布、线粒体膜电位，β-Gal染色检测细胞衰老情况。（2）多肽处理细胞后，MPTP（4mM）诱导细胞线粒体损伤，流式细胞术检测细胞活性氧水平、线粒体膜电位、细胞凋亡比例，透射电镜观察不同组细胞内线粒体形态。Western-blot法检测细胞凋亡和线粒体自噬相关蛋白表达水平。 动物实验： C57BL/6腹腔注射MPTP构建PD小鼠模型，将C57BL/6雄性小鼠随机分为Ctrl组，MPTP（30mg/kg）组，多肽P2(50mg/kg)组，多肽+二甲双胍（P2+MET）组，MET（100mg/kg）组。（1）进行悬挂实验、旷场实验、悬尾实验、高架十字迷宫实验和蔗糖偏好试验。（2）ELISA法检测小鼠血清和脑组织中炎症因子TNF-α，IL-1β和IL-6的水平。（3）甲苯胺蓝染色法和免疫组化法分别检测小鼠脑组织海马区神经细胞与中脑组织多巴胺神经元受损情况。（4）Western-blot法检测小鼠脑组织中凋亡相关蛋白，线粒体功能相关蛋白及线粒体自噬相关蛋白的表达水平。结果： 细胞实验： （1）多肽P1和P2减轻H2O2对细胞的损伤，明显增加细胞存活率，降低H2O2所致细胞G1期阻滞比例，升高H2O2损伤的细胞线粒体膜电位，一定程度上改善了H2O2诱导的细胞衰老。 （2）P1和P2（10μM、50μM），以及与MET（600μM）共同处理细胞，均能增加MPTP损伤后的细胞存活率。其中P2显著抑制活性氧水平升高，并明显升高线粒体膜电位，抑制细胞凋亡。细胞不受MPTP损伤时，P2和MET均能促进线粒体自噬相关蛋白表达，促进线粒体自噬激活。细胞受MPTP损伤时，P2和MET抑制MPTP诱导的线粒体自噬过度激活及其造成的异常线粒体堆积。干扰Parkin蛋白表达后，P2以及MET均不能挽救MPTP诱导细胞受损所致存活率降低，并且无法抑制MPTP诱导的线粒体自噬的过度激活。 动物实验： 与MPTP造模的PD小鼠比，多肽P2组以及MET组小鼠体重增加，悬挂时间延长，悬挂能力增强，相对静止时间延长，蔗糖偏好率降低，血清和脑组织中炎症因子TNF-α和IL-1β水平降低，黑质多巴胺神经细胞和海马区神经细胞增加，脑组织中凋亡相关蛋白的表达降低，线粒体动力学相关蛋白表达增加，部分线粒体自噬相关蛋白表达降低。 结论： 多肽P2和MET具有有效的神经保护作用以及线粒体保护作用。多肽P2和MET均可以降低H2O2和MPTP对线粒体的损伤，对SH-SY5Y细胞、C57BL/6小鼠多巴胺神经细胞以及海马区神经细胞有保护作用，维持线粒体膜电位及线粒体动力学平衡，抑制损伤所致的线粒体自噬过度激活。
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