摘要
研究背景 由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2）感染引起的全球新型冠状病毒肺炎(Coronavirusdisease，COVID-19)的大流行，导致了严重的公共卫生负担和社会经济危机。中和抗体已被证明对治疗轻度和中度COVID-19患者非常有效。然而，由病毒快速突变产生的一系列Omicron亚型株逃逸了大多数商业化的治疗性抗体。 面对不断变异的新冠病毒以及单一抗新冠病毒中和抗体面临的耐药威胁，筛选或设计靶向SARS-CoV-2高保守位点的广谱中和抗体以及抗体的组合可能是解决病毒变异株免疫逃逸的有效措施。迄今为止，还没有一种鸡尾酒抗体或广谱抗体被证明对突变介导的抗体逃逸完全免疫。综合考虑，开发靶向不同表位的抗体组合可以为COVID-19提供额外的治疗选择。 前期实验研究中我们利用B细胞培养结合抗体克隆技术，从SARS-CoV-2感染康复患者外周血中筛选出一系列靶向新冠病毒不同表位的特异性抗体。抗体依据与病毒S糖蛋白结合分为NTD、RBD和S2特异性抗体。本研究拟探讨特异性抗体对Omicron的中和活性以及对其关键突变位点的结合能力，以筛选出有效中和不同变异株的抗体组合。 第一部分Omicron变异株关键突变位点对人源中和抗体识别的影响 研究内容及目的： 采用定点突变的方法构建了含有Omicron关键突变位点的S1质粒，利用捕获ELISA法分析抗体825、843、809、826和846与突变位点S1蛋白的结合能力，明确关键突变位点对抗体识别的影响，预测对5株抗体产生逃逸的突变位点可能有哪些。 研究方法： 1.关键突变位点质粒的构建及表达：设计好含关键突变位点的引物，经PCR扩增含有突变位点的目的序列，转化目的序列到DH5α感受态细胞，挑克隆送测序，测序结果与模板质粒序列经SnapGene比较，如为目的突变位点序列，扩大生产质粒，经转染到HEK293T细胞中进行突变位点蛋白的表达。 2.捕获ELISA方法：用鼠抗包被ELISA板，可捕获表达成功的突变位点S1蛋白抗原，加入筛选出来的中和抗体，再加入带有HRP标记的羊抗人IgG(H+L)，在底物TMB催化下显色。分析抗体与含Omicron关键突变位点S1蛋白抗原的结合情况。 研究结果： 1.一系列关键突变位点的选择 依据大量文献报道，本实验总结了一些造成已获批准的COVID-19治疗性抗体逃逸的关键突变位点T19I，del24-26，A27S，G142D，del143-145，S371L，S371F，S373P，S375F，D405N，K417N，N440K，G446S，E484A，Q493R，G496S，Q498R，N501Y，Q493R+G496S，Q493R+Q498R。 2.关键突变位点质粒的构建与表达 应用SnapGene软件将生工生物公司反馈的测序结果与模板序列进行比对分析，结果表明，利用点突变方法成功构建了含20处关键突变位点的质粒。将上述构建的部分关键突变位点质粒转染HEK293T细胞进行表达，经WesternBlot分析表达鉴定，所有关键突变位点蛋白成功表达，条带大小正确。 3.关键突变位点抗原稀释度的选择 为接下来的ELISA实验做准备，避免所用抗原过度饱和，提高实验的灵敏性，本研究对表达的关键突变位点抗原进行梯度稀释，用特异性抗体对抗原进行了定量，选择相应的抗原稀释度。 4.含Omicron关键突变位点的S1蛋白对抗体结合能力的影响 809、826和843对带有单点突变S371F、S375F和G446S的S1蛋白的结合能力降低，S371F和S375F降低了809、826、825和843对S1蛋白的结合能力。T19I、S371F和del143-145降低了NTD区域单抗846对S1蛋白的结合能力，RBD区域的突变位点对846抗体基本不会产生影响。 综上，抗体809、826、825、843对NTD区域的关键突变位点有较好的结合能力，结合能力减弱主要集中在S371F、S375F和G446S位置；846对带有突变的T19I、del143-145和S371F蛋白结合能力降低。 结论： 5株抗体对大部分Omicron关键突变位点有较好的结合能力。S371F、S375F和G446S降低了抗体809、826、825、843的结合能力，T19I、del143-145和S371F降低了846抗体的结合能力，预示这些位点的突变有可能使5株抗体对Omicron变异株的中和作用降低或产生逃逸。 第二部分基于流式细胞技术SARS-CoV-2假病毒中和实验方法的建立及人源中和抗体对Omicron变异株中和活性的评估 研究内容及目的： 建立SARS-CoV-2假病毒中和系统，并探讨已获得针对SARS-CoV-2RBD区域的中和抗体825、843、809、826和NTD区域的中和抗体846对Omicron变异株的中和作用，以筛选出有效中和不同变异株的抗体组合。 研究方法： 1.基于流式细胞技术SARS-CoV-2假病毒中和实验方法的建立：使用HIV-1慢病毒骨架蛋白包装系统，将psPAX2、pLVX-eGFP、p19eH-IgG1-WTS或pcDNA3.1(+)-OmicronS三质粒共转染HEK293T细胞，包装一种带增强型绿色荧光蛋白eGFP的假病毒。通过优化S蛋白密码子序列、采用S蛋白C-端氨基酸AA截短和包装时间的优化，确定假病毒包装最适条件。采用293T-hACE2细胞作为感染靶细胞，经流式细胞仪测定eGFP荧光细胞比率即为感染假病毒细胞比率。 2.抗体对假病毒中和活性的检测：采用所建立的假病毒中和系统，分析抗体825、843、809、826和846对不同假病毒的中和能力。 研究结果： 1．SARS-CoV-2S蛋白表达质粒的构建 本实验成功构建了C端截短19个氨基酸的SARS-CoV-2WTS蛋白重组表达载体（p19eH-IgG1-WTS），以及使用C端截短21个氨基酸的OmicronS蛋白重组表达载体（pcDNA3.1(+)-OmicronS）。经测序分析显示S蛋白编码基因已成功插入载体，且序列是正确的。同时两种病毒株S蛋白表达载体经双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳结果显示，酶切产生目的S基因大小与预期大小一致，大约为3.8kb。 2．SARS-CoV-2S蛋白的表达和鉴定 将表达质粒p19eH-IgG1-WTS或pcDNA3.1(+)-OmicronS瞬间转染HEK293T细胞。首先采用WesternBlot法鉴定S蛋白的表达，结果显示，WT和Omicron均显示2个主要的蛋白条带，与预期的S蛋白(约180kD)和S1蛋白(约110kD)大小一致。 进一步采用免疫荧光法验证细胞表面S蛋白的表达，结果表明，WT和Omicron变异株的S蛋白均可在HEK293T细胞表面表达，而转染空载体的HEK293T细胞不表达任何S蛋白。这些数据表明携带WT或OmicronS蛋白的重组质粒可用于假病毒包装。 3．假病毒的包装和优化 本研究采用基于HIV-1骨架的三质粒慢病毒包装系统，将psPAX2、pLVX-eGFP与p19eH-IgG1-WTS或pcDNA3.1(+)-OmicronS三质粒共同转染HEK293T细胞，成功包装一种带eGFP标签的假病毒。 研究中我们观察了转染24h、48h及72h不同时间点收集的病毒液对包装病毒滴度的影响。结果显示，WT及Omicron变异株假病毒滴度均在72h达到峰值水平，分别为73.03%和69.67%。 4．基于流式技术的假病毒中和实验方法的建立和验证 本研究利用感染Omicron变异株的新冠肺炎患者血浆抗体对所建立方法系统的病毒中和能力进行了检测，结果表明建立的基于流式技术的假病毒中和实验方法是特异的。 同时我们采用常规使用的基于荧光素酶报告基因检测方法(LUCA)对同样血浆样品抗体中和活性进行了测定，并与FCM方法所得结果进行了相关性分析。研究结果表明建立的FCM方法与常规使用的LUCA法具有同等的敏感性。同时我们使用商业化抗体REGN10933，对所建立FCM方法包装的SARS-CoV-2WT假病毒进行重复性检测，平均IC50为4.358ng/mL，这与之前所报道的结果是一致的。 5．假病毒中和实验 抗体826、809、825和843均能中和SARS-CoV-2WT；抗体826、809和825可有效中和Omicron变异株；843抗体对Omicron变异株产生逃逸；826为保守表位的抗体；846抗体对WT和Omicron两种假病毒均未显示出中和活性。 结论： 本研究成功建立了基于流式细胞技术的SARS-CoV-2假病毒中和实验方法，并运用该系统检测了5株抗体对Omicron变异株的中和活性。结合第一部分研究结果可知，S371F和S375F突变降低了825抗体对Omicron的中和活性；S371L和G446S突变使843抗体对Omicron变异株产生逃逸；S371L、S371F、S375F和G446S突变基本不会对826和809抗体产生影响。不同表位的抗体826、843和825之间，826、843和846之间的组合有望作为临床上治疗COVID-19的候选抗。
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