摘要
肝硬化是困扰国内外研究人员的重大公共健康问题，世界范围内每年因慢性肝病死亡人数约有200万人。而终末期肝脏疾病最常见的病理过程就是肝纤维化，可序贯进展为肝硬化、肝功能紊乱衰竭，甚至最终进展为肝恶性肿瘤。肝纤维化是影响肝脏疾病发展及预后的关键因素，这使得研究改善肝纤维化，有利于提高肝病患者长期生存质量，降低社会医疗负担。因此人们的研究方向尽可能多的放在了早期疾病发生发展的干预。肝星状细胞（HSCs）是肝纤维化的中心关键细胞，未受到内外源刺激时处于静止状态，当炎性细胞趋化及炎性分子大量分泌时，肝星状细胞被激活，参与肝纤维化的进程。未成熟树突状细胞（imDC）不仅能诱导免疫耐受，使免疫低反应，还具有强大的分泌抗炎症因子的作用，已有研究表明其可通过抗炎相关机制改善纤维化的进程。miR-155被发现广泛参与了DC成熟及发挥相应功能，相关实验研究发现，敲低或抑制miR-155的DC可维持其未成熟状态，从而发挥imDC的抗炎及诱导免疫耐受的作用。本篇论文通过体外实验研究慢病毒转染反义miR-155至大鼠骨髓源imDC对活化的大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响。 【目的】 构建大鼠反义miR-155(microRNA-155,微小RNA-155)慢病毒载体并鉴定，诱导并培养大鼠骨髓源性imDC，重组反义miR-155慢病毒载体转染大鼠imDC。研究抑制miR-155的大鼠骨髓源imDC对激活的大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响。 【方法】 1.大鼠骨髓源imDC的诱导培养与鉴定：获取大鼠胫骨和股骨骨髓细胞，加入10ng/mL的rrGM－CSF及10ng/mL的rrIL－4诱导7天，获得大鼠imDC，继续加入LPS获得大鼠成熟DC（mDC），使用流式细胞仪及透射电镜进行DC细胞免疫表型及超微结构观察。 2.构建反义miR-155慢病毒载体并鉴定：将慢病毒载体酶切，与目的基因反义miR-155的退火双链DNA连接，获得的产物加入感受态细胞中培养。将培养出的载体进行测序。包装慢病毒载体，经浓缩纯化后，使用有限稀释法测定病毒滴度。 3.imDC中miR-155表达鉴定：用重组慢病毒载体转染大鼠的imDC，荧光定量RT-qPCR检测miR-155在imDC中的表达。 4.HSC的激活：使用5ng/ml的TGF-β刺激HSC，于细胞培养箱中诱导48h后获得活化的HSC。 5.实验分组：①HSC空白对照组;②TGF-β诱导激活的HSC组;③TGF-β诱导激活的HSC和imDC共培养组;④TGF-β诱导激活的HSC和imDCanti-miR-155共培养组;⑤TGF-β诱导激活的HSC和mDC共培养组; 6.抑制miR-155的imDC对激活的肝星状细胞抑制作用的研究：我们通过Transwell小室(孔径0.4μm)，将HSC与imDC/imDCanti-miR-155/mDC以1∶2的比例共培养，建立了上下双细胞共培养体系。将imDC/imDCanti-miR-155/mDC接种于上室，活化的HSCs接种于下室。共培养48h后使用流式细胞仪检测HSCs的凋亡率，EdU检测HSCs的增殖情况。 【结果】 1.从大鼠骨髓细胞中分离获得单个核细胞，联合使用rrGM－CSF和rrIL－4诱导7天后获得imDC，加入LPS诱导获得mDC。通过流式细胞仪鉴定获得的细胞表面标记物符合典型的imDC及mDC表型。光镜及透射电镜下可见在形态学上符合典型的imDC和mDC的形态特征。满足后续共培养实验要求。 2.构建反义miR-155慢病毒载体，将培养出的载体进行测序，载体序列含目的基因。 3.通过反义miR-155与慢病毒载体连接，成功构建大鼠反义miR-155慢病毒载体，用重组的慢病毒载体感染大鼠imDC，经RT-qPCR检测到imDC中miR-155显著下调，目的基因在靶细胞内成功表达。转染后的imDCanti-miR-155在炎性介质LPS的刺激下未转化为mDC，仍保持了imDC的表达状态。 4.镜下观察HSCs加入TGF-β后成功激活，细胞呈纤维细胞形态。 5.流式细胞术检测HSCs凋亡结果提示，imDC与imDCanti-miR-155均能促进活化的HSCs凋亡，且imDCanti-miR-155组促凋亡效果更明显（P＜0.0001），而mDC对活化的HSCs凋亡无促进作用（凋亡率：A:HSC组：9.54±1.60％；B:HSC+TGF-β组9.12±1.38％;C:HSC+TGF-β+imDC组：22.07±0.75％；D:HSC+TGF-β+imDCanti-miR-155组：38.37±0.93％；E:HSC+TGF-β+mDC组：8.56±2.02％） 6.EdU结果提示与HSCs激活组相比较，imDC与imDCanti-miR-155均能抑制活化的HSCs增殖，（imDC组：P＜0.01；imDCanti-miR-155组：P＜0.0001），且imDCanti-miR-155抑制增殖的能力更强（P＜0.0001），mDC组未能抑制活化的HSCs组增殖。（mDC组：P＝0.3149） 【结论】 1.抑制miR-155表达的imDCanti-miR-155在炎症背景下仍可维持未成熟状态。 2.imDCanti-miR-155可抑制激活的大鼠HSCs增殖，且其抑制作用强于未转染imDC，而mDC对激活的HSCs增殖作用无影响。 3.imDCanti-miR-155可促进激活的大鼠HSCs凋亡，且其促进作用强于未转染imDC，而mDC对激活的HSCs凋亡作用无影响。
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