摘要
【目的】结合单细胞RNA测序和差异基因表达分析，解析EGFR基因突变对肺癌免疫微环境的影响，以期为EGFR突变患者临床治疗提供新的思路。 【方法】结合TCGA数据库分析EGFR表达对患者预后的影响；通过入排标准筛选初治的胸部占位患者，签署知情同意后，通过手术或穿刺的方法获得组织样本，行HE染色明确病理组织学类型后，针对肺腺癌患者行探针PCR检测和免疫组化检测确认EGFR基因的突变情况；同时，完成测序样本单细胞悬液的制备和质控，对质控达标的样本继续进行单细胞分离、文库制备和测序，获取相应单细胞转录组信息，利用R语言等工具对数据进行表达矩阵、二次质量控制、基因注释、细胞聚类、差异基因富集和功能富集等完成数据分析，并进行可视化图表展示。 【结果】1.对TCGA数据库肺腺癌数据的生存分析发现，EGFR高表达组患者的中位生存时间与低表达组差异无统计学意义(p＞0.05)； 2.符合入组标准的12例初治胸部占位患者，排除非腺癌样本3例、质控不达标样本3例后，有6例样本用于后续测序分析，其中2例EGFR基因突变阴性，4例为EGFR突变阳性；分别构建了6个样本的细胞图谱，共56439个细胞，30个细胞簇。 3.通过标记基因聚类得到8种细胞类型，分别是上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、增殖细胞、B细胞、浆细胞、T细胞和髓样细胞；其中，EGFR突变阴性组主要聚类到了上皮细胞、髓样细胞以及浆细胞，而EGFR突变阳性组，上皮细胞比例较低，但髓样细胞、浆细胞、T细胞比例明显增加。 4.对髓样细胞和T细胞进行细胞亚型聚类，分别得到了8种髓样细胞亚型和5种T细胞亚型，EGFR突变阳性组中，pDC细胞(浆细胞样树突状细胞)和CD4naiveT(CD4+幼稚T细胞)比例较突变阴性组明显增高，而CD4Treg(CD4+调节性T细胞)比例较突变阴性组明显降低。 5.对EGFR突变阳性组和阴性组一级细胞的差异基因表达分析，筛选得到了各一级细胞排名前十位的差异表达基因。进一步对二级细胞分析发现，IGHG4在EGFR突变阳性组的T细胞、髓样细胞和成纤维细胞中均表达上调。 6.对EGFR突变阳性组和阴性组差异基因进行GO功能富集和KEGG通分析，发现髓样细胞表达下调基因主要富集到了免疫效应过程的正向调节和MHC-Ib类抗原的加工和递呈，提示EGFR突变可能导致了髓样细胞免疫活化效应被抑制。 【结论】1.EGFR突变导致肺腺癌髓样细胞、浆细胞和T细胞比例增加；其中，髓样细胞亚型pDC细胞和T细胞亚型CD4naiveT比例增加，而CD4Treg亚型比例下降； 2.EGFR突变阳性组的T细胞、髓样细胞和成纤维细胞中IGHG4均表达上调； 3.EGFR突变阳性组可能通过抑制髓样细胞的免疫正向调节和MHC-Ib类抗原的加工和递呈介导肿瘤微环境的免疫抑制。
NETL