摘要
猪流行性腹泻(PED)主要引起仔猪腹泻和死亡，给养猪业造成了巨大的经济损失。2010年以后，PEDV变异株的流行进一步导致我国PED的防控难度加大。本研究从四川暴发腹泻的猪场样品中分离获得一株PEDV毒株，系统鉴定了毒株的生物学特性、全基因组特征及致病性，并制备了抗N蛋白的单克隆抗体，为我国PEDV的研究和防控提供更多流行毒株的参考信息。本研究的主要内容如下： 1.PEDV四川株CHN-SC2021的分离与鉴定 将RT-PCR鉴定为PEDV阳性的腹泻病料接种Vero细胞连续传代，分离获得一株PEDV毒株。分离的PEDV毒株经过噬斑纯化、间接免疫荧光检测（IFA）、负染透射电镜鉴定，毒株命名为CHN-SC2021。动态监测了毒株的病原特性，毒株在细胞上连续传代35代，细胞出现明显病变时间由48h变为24h，滴度从104.7TCID50/mL升至106.43TCID50/mL，其中P35代生长动力学分析，48h病毒复制达峰值。全基因组测序表明CHN-SC2021（P5）（Genbank收录号：OM505025.1）全长为28014bp，与全球的主要参考毒株比较，发现CHN-SC2021与中国毒株、欧美地区毒株、亚洲其他国家毒株的同源性分别为99.16~96.32%、99.01~96.57%、98.94~96.33%；遗传进化树结果显示CHN-SC2021株与江西CH/JXJA/2017(MF375374.1)、河南CH/HNAY/2015(KT199103.1)、CH/HNKF-16(KY649107.1)毒株亲缘关系较近，属于GⅡa型毒株。S基因与其他毒株相似度在98.7%~93.4%之间，与韩国株KNU1305(KJ662670.1)、美国株IA2(KF468754.1)、USA_Colorado_2013(KF272920.1)关系密切，未发现潜在的重组事件。将CHN-SC2021口服感染6日龄哺乳仔猪，最早在12h出现食欲不振，20h时出现呕吐，24h引起仔猪厌食、剧烈呕吐和腹泻；剖检病变主要是胃肠鼓气、空肠和回肠透明；病理病变显示各肠段均有不同程度的肠绒毛病变、脱落、结缔组织疏松、黏膜肌层与肌层间距增宽等；免疫组化显示小肠各段均有病毒，回肠中病毒最多。 2.CHN-SC2021的N蛋白表达及单克隆抗体制备 本研究扩增了CHN-SC2021毒株全长N基因、插入pET-28a(+)载体构建了pET-28a-N重组质粒，通过IPTG诱导表达获得大小约60kDa的N蛋白，表达蛋白主要存在与细菌上清液。用纯化的重组N蛋白构建了间接ELISA方法，N蛋白抗原最佳包被浓度为1μg/孔。用N蛋白免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）融合，筛选到反应原性最好的一株杂交瘤细胞8F12制备单克隆抗体。用8周龄雌性Balb/c小鼠进行腹腔注射，制备腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法和ProteinG纯化柱两种方式纯化腹水，获得1：102400高效价的单克隆抗体。鉴定结果表明该单抗重链属于IgG1型，轻链属于Kappa型；制备的单抗能够特异性识别PEDV-N蛋白，与TGEV、PDCoV无交叉反应，。N蛋白单抗与细胞中的PEDV病毒发生特异性反应，免疫组化表明N蛋白单抗可与PEDV感染猪的十二指肠、空肠、回肠中的病毒发生特异性结合。本研究制备的N蛋白单克隆抗体为后续的PEDV的鉴定和诊断等研究提供了科研素材。
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