摘要
【目的】通过研究人脐带间充质干细胞来源外泌体（Humanumbilicalcordmesenchymalstemcell-derivedexosomes，HUCMSC-exos）对MPP+诱导人神经母细胞瘤细胞（Humanneuroblastomacell，SH-SY5Y）建立细胞模型和MPTP诱导的帕金森氏病（Parkinson''sdisease，PD）小鼠模型的治疗效果以及是否能抑制NLRP3炎症小体的激活来缓解神经炎症，从而探索新型治疗方法，弥补现有治疗方法的不足，为HUC-MSC-exos治疗PD在再生医学中的应用提供理论基础和实验依据。 【方法】1、HUC-MSCs基本特征和特定功能的鉴定：CCK8检测不同代次HUC-MSCs细胞活力；流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD73、CD34和CD45表达情况；对HUC-MSCs进行成骨和成脂诱导，分别用油红O、茜素红和碱性磷酸酶(ALkalinePhosphatase，ALP)染色法鉴定其多项分化的潜能。 2、HUC-MSC-exos的分离、提取和鉴定：通过超速离心法提取外泌体；透透射电镜观察外泌体（Exosomes）形态；纳米粒径跟踪分析（Nanoparticletrackinganalysis，NTA）检测其粒径大小、浓度和纯度；Westernblot鉴定Exosomes表面标志蛋白Alix、CD63、CD9和CD81的表达。 3、HUC-MSC-exos对MPP+诱导的细胞模型的作用及影响：分别将0mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM的作用于SH-SY5Y细胞，通过CCKMPP+8检测24h后SH-SY5Y细胞活力，探讨出建立细胞模型MPP+的最佳浓度；PKH67标记外泌体，观察SH-SY5Y细胞对外泌体的摄取情况；通过0ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、60ug/mL、80ug/mL、100ug/mL、120ug/mL的HUC-MSC-exos作用24hSH-SY5Y细胞后再次用1mM的MPP+处理24h后，CCK8检测SH-SY5Y细胞活力，探讨出HUC-MSC-exos作用SH-SY5Y细胞最佳浓度；再次通过CCK8和FCM检测三组NC组、MPP+和MPP+/EXOs组SH-SHY5Y细胞的活力和凋亡情况；ELISA检测三组细胞上清液IL-1β和IL-18的表达情况；WB检测三组细胞NLRP3、Caspase-1和ASC的表达情况。 4、HUC-MSC-exos对PD小鼠模型的作用及影响：将54只雄性C57BL/6小鼠按照随机原则分为生理盐水对照组(NC)、MPTP组（MPTP）和MPTP+外泌体组（MPTP/EXOs）一共三组，每组18只。PKH67标记外泌体，观察外泌体能否通过血脑屏障到达小鼠脑黑质致密部并被多巴胺能神经元摄取；首先MPTP组和MPTP/EXOs组通过连续5天腹腔注射MPTP(30mg/kg)建立小鼠的亚急性PD模型，同时NC组连续5天腹腔注射生理盐水，之后NC和组MPTP组小鼠连续7天尾静脉注射100uL的PBS，同时MPTP/EXOs组小鼠连续7天尾静脉注射100uL的外泌体；腹腔注射MPTP前、注射MPTP后和尾静脉注射外泌体后对小鼠进行爬杆实验、悬挂实验和转棒实验评估小鼠行为学变化；行为学评估结束后眼球取血处死小鼠后取小鼠脑部组织，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining，HE)观察各组小鼠脑黑质致密部；免疫组化检测各组小鼠脑黑质致密部和纹状体酪氨酸羟化酶（TH）的阳性表达水平；免疫荧光检测各组小鼠脑黑质致密部TH、α-突触核蛋白（α-syn）的表达；WB检测各组小鼠脑黑质致密部TH、α-突触核蛋白（α-syn）、NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-1β的表达情况。 【结果】1、HUC-MSCs基本特征和特定功能的鉴定结果：CCK8结果显示P3代到P7代HUC-MSCs细胞增殖能力旺盛；FMC结果表示HUC-MSCs高表达CD90和CD73，低表达CD34和CD45；HUC-MSCs成骨诱导后，茜素红染成橘红色，ALP染成蓝黑色，HUC-MSCs成脂诱导后，油红O染色可观察到红色的脂滴。 2、HUC-MSC-exos的分离、提取和鉴定结果：透射电镜观察外泌体呈现茶托样双层膜结构且边界清晰；NTA鉴定外泌体浓度在8X107-8X1010Particles/ml，纯度为100%，直径在30-200nm之间；WB结果显示，外泌体表达表面标志蛋白Alix、CD63、CD9和CD81。 3、HUC-MSC-exos对SH-SY5Y细胞模型的作用及影响：CCK8结果显示1mM的MPP+处理SH-SY5Y细胞24h后细胞活力在50%左右；HUC-MSC-exos可被SH-SY5Y细胞摄取；80ug/mL的外泌体预处理SH-SY5Y细胞后可很好的保护MPP+诱导细胞的活力及逆转细胞的凋亡；ELISA结果显示，HUC-MSC-exos处理后可降低MPP+诱导的细胞模型的细胞上清液IL-1β和IL-18炎症因子的表达；WB结果显示，HUC-MSC-exos处理后可降低MPP+组细胞NLRP3、Caspase-1和ASC的表达。 4、HUC-MSC-exos对PD小鼠模型的作用及影响：HUC-MSC-exos可通过血脑屏障到达小鼠脑黑质致密部并被多巴胺能神经元摄取；爬杆实验、悬挂实验和转棒实验显示，HUC-MSC-exos处理可降低PD小鼠爬杆时间、增加悬挂得分和增加在转棒仪上坚持的时间和转速；HE结果显示HUC-MSC-exos处理可减少PD小鼠脑黑质致密部细胞的损伤；免疫组化结果显示HUC-MSC-exos处理可增加PD小鼠脑黑质致密部和纹状体TH阳性神经元；免疫荧光结果和WB结果显示HUC-MSC-exos处理可增加PD小鼠TH的表达和降低α-syn的表达；WB的结果还显示HUC-MSC-exos处理可减少PD小鼠NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-1β的表达。 【结论】在MPP+诱导的PD细胞模型中，HUC-MSC-exos预处理SH-SY5Y细胞后可以增加PD细胞模型的细胞活力和降低细胞的凋亡，其保护机制可能与抑制细胞中NLRP3炎症小体的激活有关。其次，在MPTP诱导的PD小鼠模型中，HUC-MSC-exos治疗可保护PD小鼠中脑黑质-纹状体多巴胺能神经元，改善PD小鼠运动功能，其机制可能与抑制PD小鼠中NLRP3炎症小体的激活，发挥抗神经炎症的作用有关。
NETL