摘要
背景 帕金森病(Parkinson''sdisease，PD)是一类常见的神经系统退行性疾病，主要临床表现为运动迟缓、震颤及肌强直，主要病理表现为黑质多巴胺能神经元的变性死亡。大多数患者为散发性，少数为基因突变引起的遗传性帕金森病。目前，相当部分基因变异导致帕金森病/帕金森综合征的分子机制尚不明确。研究发现，人类特有的NOTCH2NLC基因5''非翻译区的GGC重复扩增突变与神经元核内包涵体病(Neuronalintranuclearinclusiondisease，NIID)的发生相关。部分携带NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变的NIID患者可合并锥体外系表现，且部分家族性NIID患者可表现为以帕金森综合征为主的临床表型，提示NOTCH2NLC基因的GGC重复扩增突变可能与帕金森病/帕金森综合征关系密切。 目的 本研究拟在中国汉族人群帕金森病、帕金森综合征患者队列中探索NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变与帕金森病/帕金森综合征的关系，并通过NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性患者来源的iPSC细胞系分化的3D类脑器官模型及2D神经元模型，结合转染不同次数NOTCH2NLC基因特异性GGC重复扩增突变质粒的细胞模型，共同探讨NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变导致帕金森病/帕金森综合征的可能致病机制。 方法 1纳入1011例原发性帕金森病患者、26例帕金森综合征患者及1134例正常对照，筛选NOTCH2NLC基因的GGC重复扩增突变，探讨NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变与中国汉族人群帕金森病/帕金森综合征的关系; 2对比携带不同次数范围GGC重复扩增突变的帕金森病患者及帕金森综合征患者的临床、影像、病理表现及重复序列中各重复单元的占比; 3构建含20、50、90次GGC重复的NOTCH2NLC基因特异性质粒，及表达上述质粒的细胞模型，探讨不同次数NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变编码蛋白在细胞中的分布差异; 4运用上述细胞模型，探讨不同GGC重复次数对细胞核内包涵体形成、自噬、核仁应激、核糖体生成、应激颗粒形成及全细胞蛋白合成的影响; 5运用上述细胞模型，结合免疫共沉淀及蛋白质谱，探索不同次数NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变编码蛋白的高亲和蛋白; 6利用NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性（≥90次）帕金森综合征表型NIID患者的皮肤成纤维细胞，重编程为iPSC细胞系，并进一步分化为患者来源的2D神经元模型; 7运用上述构建的NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性（≥90次）帕金森综合征表型NIID患者来源的2D神经元模型及实验室已构建的同患者来源的3D类脑器官模型，探讨NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变对核内包涵体形成、NOTCH2NL表达、自噬及整合应激反应的影响; 8运用上述构建的NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性（≥90次）帕金森综合征表型NIID患者来源的2D神经元模型，结合bulkRNA测序，探讨NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变可能的致病机制。 结果 1发现4例帕金森综合征患者携带NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变，11例帕金森病患者携带41-60次的GGC重复扩增突变，未发现正常对照携带超过40次的GGC重复扩增突变。统计分析示NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变与帕金森综合征有关，而41-60次的GGC重复扩增突变与帕金森病有关; 2携带NOTCH2NLC基因90次及以上GGC重复扩增突变的帕金森综合征患者临床上可合并严重的认知障碍及自主神经功能障碍，影像上可表现为DWI皮髓交界处高信号及不同程度的脑白质病变，皮肤病理示泛素染色阳性的核内包涵体沉积;携带41-60次GGC重复扩增突变的帕金森病患者临床表现为典型的帕金森病，影像上不合并上述表现，皮肤病理示磷酸化的α-突触核蛋白沉积;重复序列中，携带41-60次GGC重复扩增突变的帕金森病患者较携带90次及以上GGC重复扩增突变的帕金森综合征患者示更高的GGC占比; 3成功构建含20、50、90次GGC重复的NOTCH2NLC基因特异性质粒及表达上述质粒的细胞模型。在细胞模型中，90次GGC重复扩增突变的编码蛋白示聚集性分布，而20、50次GGC重复扩增的编码蛋白未见聚集; 4在细胞模型中，NOTCH2NLC基因90次的GGC重复扩增突变可编码含90次多聚甘氨酸（polyG）的蛋白，参与核内包涵体的形成。90次的GGC重复扩增突变可刺激增强细胞的自噬、核仁应激、应激颗粒形成水平，损伤核糖体生成及全细胞蛋白合成过程。50次的GGC重复扩增突变对上述指标的影响不明显; 5蛋白质谱结合亲和性分析示，与NOTCH2NLC基因50、90次GGC重复扩增突变编码蛋白高亲和的蛋白均功能富集到RNA转运、RNA结合及细胞内无膜细胞器通路上; 6成功构建NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性（≥90次）帕金森综合征表型NIID患者来源的iPSC模型及2D神经元模型，相关指标鉴定正确; 7在上述构建的患者来源的2D神经元模型及实验室已构建的同患者来源的3D类脑器官模型中，NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变转录产生的重复RNA及编码产生的含polyG的蛋白可同时参与核内包涵体的形成。90次及以上的GGC重复扩增突变可增强细胞的自噬流及导致细胞整合应激反应的活化，但不影响NOTCH2NL的表达水平; 8患者来源的2D神经元bulkRNA测序示NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变可能导致核糖体及翻译功能障碍。 结论 1NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变与运动障碍疾病相关，其中90次及以上的扩增突变可导致帕金森综合征表型的NIID,41-60次的扩增突变可增加帕金森病的发病风险; 2成功构建NIID细胞模型及NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性（≥90次）帕金森综合征表型NIID患者来源的2D神经元模型。上述模型可还原NIID特征性的病理改变，可用来探索NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变的致病机制; 3NOTCH2NLC基因50、90次GGC重复扩增突变编码蛋白可与RNA转运及结合相关蛋白高亲和，可能损伤其功能，参与疾病发生; 4NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变产生的重复RNA及含polyG的蛋白均参与核内包涵体的形成; 5NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变可刺激增强模型的自噬、整合应激反应、核仁应激、应激颗粒形成水平，损伤核糖体生成及全细胞蛋白合成，可能导致细胞毒性及疾病发生。
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