摘要
目的：血管内皮细胞（VascularEndothelialCells，VECs）是血管内壁一层排列紧密的扁平上皮细胞。正常情况下，通过分泌血管活性物质参与血管新生、血管舒缩、凝血平衡、平滑肌细胞增殖及炎症反应等过程的调节。然而VECs受到炎症等有害刺激后，其结构受到损伤，功能发生障碍，表达大量粘附分子，打破了血管平衡稳态，参与肿瘤及心脑血管性疾病等多种疾病的发生发展。 VECs结构损伤和功能障碍与动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)进展密切相关。在AS发展的整个过程中，始终有炎症因子的参与。白介素-8（Interleukin-8，IL-8）作为趋化因子家族的一种多细胞源性细胞因子，在AS斑块形成的早期就会大量表达，过量表达的IL-8可显著引起中性粒细胞的定向游走从而实现对炎症反应的调节，并且可以促进单核细胞与VECs的紧密粘附。所以本研究中选择IL-8作为体外炎症诱导剂。 随着全基因组测序技术的不断发展，研究发现长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）在血管性疾病的发生发展中起着至关重要的作用。核仁小RNA宿主基因5（smallnucleolarRNAhostgene5，SNHG5，基因ID：387066），也称为U50HG，是长度为524bp的lncRNA。近年来研究发现它作为癌基因或抑癌基因，在多种肿瘤中发挥功能，但其在血管性疾病及VECs中的功能作用未见报道。本研究前期结果初步证明，lncRNASNHG5在IL-8诱导的人脐静脉内皮细胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVECs）中表达下调，提示lncRNASNHG5可能参与调节IL-8诱导的内皮细胞炎症反应过程，因此本研究以HUVECs为研究对象，探究lncRNASNHG5对IL-8诱导的HUVECs功能的影响，并对其潜在的分子机制进行初步探讨，以期为深入研究血管性疾病的发生发展提供思路和理论基础。 方法：（1）通过MTT细胞增殖实验、内皮细胞粘附实验、Westernblot、实时定量PCR（QuantitativeReal-timePolymeraseChainReaction，qPCR）技术及流式细胞术等方法探究IL-8对HUVECs增殖、粘附、凋亡等功能及细胞间粘附分子-1（IntercellularAdhesionMolecule-1，ICAM-1）、血管内皮粘附分子-1（VascularCellAdhesionMolecule-1，VCAM-1）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）等分子表达的影响；（2）利用qPCR技术检测IL-8诱导的HUVECs中lncRNASNHG5在mRNA水平的表达变化；（3）设计并构建lncRNASNHG5的重组质粒和小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA），并通过脂质体转染的方法，将其转染进HUVECs中，利用qPCR技术检测lncRNASNHG5的表达变化，验证转染效率；（4）通过MTT细胞增殖实验及Westernblot等方法分别检测lncRNASNHG5对HUVECs增殖功能及增殖细胞核抗原（ProliferatingCellNuclearAntigen，PCNA）蛋白表达的影响；（5）通过内皮细胞粘附实验检测lncRNASNHG5对细胞粘附功能的影响；（6）通过Westernblot方法检测lncRNASNHG5对HUVECs中粘附分子ICAM-1和VCAM-1在蛋白水平表达的影响；（7）利用qPCR技术检测lncRNASNHG5对HUVECs中粘附分子ICAM-1及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α等在mRNA水平表达的影响；（8）通过流式细胞术及Westernblot方法分别评价lncRNASNHG5对HUVECs凋亡功能及Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2AssociatedXProtein，BAX）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinylaspartatespecificproteinase-3，Caspase-3）、Caspase-9等凋亡相关蛋白表达的影响；（9）通过Westernblot及细胞免疫荧光技术探究lncRNASNHG5对Wnt/β-catenin信号通路分子的影响。 结果：（1）IL-8促进PCNA、CyclinD1等增殖相关蛋白及ICAM-1、VCAM-1等粘附相关蛋白的表达，促进HUVECs增殖及其与急性单核细胞性白血病患者外周血单核细胞系THP-1细胞之间的粘附作用；同时，IL-8促进粘附分子ICAM-1及炎症因子IL-1β、TNF-α在mRNA水平的表达，但对IL-6的表达无明显影响；IL-8对细胞凋亡及凋亡相关蛋白BAX、Caspase-3、Caspase-9的表达均无明显影响；（2）在IL-8作用下，HUVECs中lncRNASNHG5的表达量下调，且在IL-8浓度为50ng/mL，作用时间为24h时下调最为明显；（3）上调lncRNASNHG5抑制细胞增殖及PCNA蛋白的表达，下调lncRNASNHG5促进细胞增殖及PCNA蛋白的表达；（4）上调lncRNASNHG5减少细胞粘附数量，并抑制粘附分子ICAM-1和VCAM-1在蛋白水平的表达；下调lncRNASNHG5增加细胞粘附数量，并促进粘附分子ICAM-1在蛋白水平的表达；同时，上调lncRNASNHG5抑制粘附分子ICAM-1及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α等在mRNA水平的表达；下调lncRNASNHG5促进粘附分子ICAM-1及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α等在mRNA水平的表达；（5）上调或下调lncRNASNHG5对细胞凋亡及凋亡相关蛋白BAX、Caspase-3、Caspase-9的表达均无明显影响；（6）下调lncRNASNHG5促进β-catenin蛋白的核移位及β-catenin蛋白的表达；上调lncRNASNHG5抑制β-catenin及CyclinD1蛋白的表达。 结论：（1）IL-8促进HUVECs增殖和粘附及炎症因子IL-1β、TNF-α的表达，但对IL-6的表达及细胞凋亡无明显影响；（2）IL-8诱导的HUVECs中lncRNASNHG5表达下调；（3）上调lncRNASNHG5抑制HUVECs增殖和粘附及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，下调lncRNASNHG5促进HUVECs增殖和粘附及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达；（4）上调或下调lncRNASNHG5对细胞凋亡均无明显影响；（5）lncRNASNHG5通过调节Wnt/β-catenin信号通路分子发挥生物学功能。
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