摘要
营养期杀虫蛋白（Vegetativeinsecticidalprotein，Vip）是由某些苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）在营养生长期合成并分泌到胞外的蛋白。Vip蛋白的杀虫谱广泛，对鳞翅目害虫有良好的杀虫活性。Vip3蛋白与Bt产生的另一种广泛应用的杀虫晶体蛋白（Cry）相比，其蛋白结构、受体种类和作用机理都不相同。在昆虫逐渐对Cry蛋白产生抗性的条件下，Vip3蛋白的应用可以有效提高杀虫效率并且延缓昆虫抗性的发展。因此，Vip3蛋白也被称为第二代杀虫蛋白。本研究对Vip3Aa的作用受体、杀虫机理和应用进行了探究。 本研究首先对Vip3Aa与草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda）Sf9细胞中抗增殖蛋白2（prohibitin2，PHB2）的相互作用进行探究。pulldown、斑点印迹、微量热泳动（MST）、免疫共沉淀（CoIP）和荧光共定位等实验结果证明Vip3Aa原蛋白（proVip3Aa）与PHB2直接相互作用，并且结合位点位于PHB2的SPFH（stomatin,prohibitin,flotillin,HflK/C）结构域。通过pulldown联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）实验筛选PHB2的互作蛋白，发现作为Vip3Aa受体的C类清道夫受体（scavengerreceptor-C，SR-C）是PHB2的潜在互作蛋白。pulldown、CoIP以及荧光共定位实验的结果表明PHB2能够与SR-C在细胞膜上相互作用。另外，当proVip3Aa与过量异源表达的PHB2蛋白共同孵育Sf9细胞，或敲低Sf9细胞中PHB2的表达水平，proVip3Aa的入胞水平都会下降，因此PHB2是proVip3Aa的受体。对于抗增殖蛋白1（prohibitin1，PHB1），荧光共定位、pulldown和CoIP等实验结果证明PHB1不与proVip3Aa或SR-C相互作用，敲低PHB1蛋白的表达也没有影响proVip3Aa的入胞，这表明PHB1不是Vip3Aa的受体。 proVip3Aa入胞水平的下降会导致毒力随之降低，但是PHB2的表达水平下降，proVip3Aa的细胞毒力反而升高，这意味着PHB2可能还通过其他途径影响proVip3Aa的毒力。在PHB1表达水平敲低细胞中也观察到类似现象。进一步的探究发现敲低PHB1或PHB2的表达水平会加剧proVip3Aa导致的ROS积累、线粒体膜通透性升高和线粒体膜电势下降，这表明线粒体损伤加重。PHB1或PHB2表达水平下降加剧了线粒体细胞色素c释放、caspase-3活性升高以及基因组DNA片段化，这说明细胞的凋亡水平升高。因此，PHB1和PHB2具有维持线粒体功能，帮助细胞抵抗proVip3Aa刺激的作用。PHB2在线粒体中的作用比作为受体的功能更能影响proVip3Aa的毒力。 接下来本研究探究了actVip3Aa在Sf9细胞和云衫卷叶蛾（Choristoneurafumiferana）中肠细胞（CF-203）中的作用机理。pulldown、MST、CoIP和荧光共定位实验的结果表明actVip3Aa能够与PHB2、SR-C以及纤维细胞生长因子受体（fibroblastgrowthfactorreceptor，FGFR）相互作用。actVip3Aa的入胞水平和proVip3Aa接近，并且毒力受到入胞水平的影响。actVip3Aa最终内化于溶酶体中并对溶酶体功能造成影响。结构域I中的α螺旋缺失会使actVip3Aa丧失对溶酶体pH的影响和细胞毒力，但是不会影响其入胞。actVip3Aa还会导致线粒体膜电势下降、基因组DNA损伤和caspase-3活性升高，使用caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理能够明显降低actVip3Aa的细胞毒力。这说明actVip3Aa能够诱导细胞凋亡，actVip3Aa的入胞和穿孔能力可能是其诱导细胞凋亡的必要条件。 本研究采用联合使用Vip3Aa和新型杀虫剂或RNAi的策略来提高对细胞的毒力和杀虫效率。首先，测定actVip3Aa与几种生物杀虫剂联合使用的效果。Sf9细胞毒性实验表明，actVip3Aa与印楝素、喜树碱、骆驼蓬碱和鱼藤酮具有相加效应，与多杀菌素具有协同效应。对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性测定进一步证明actVip3Aa与多杀菌素具有协同作用。其次，通过RNAi技术干扰Sf9细胞和草地贪夜蛾幼虫抗凋亡蛋白PHB1、PHB2、MCU、IAP、TCTP、DnaJ、HSP70和HSP90的表达水平能够提高Vip3Aa对Sf9细胞和草地贪夜蛾幼虫的毒力，并且PHB1、IAP和HSP90表达水平的变化对Vip3Aa毒力的影响高于其他的蛋白。最后，以PHB1蛋白为靶标优化RNAi条件，发现dsRNA的长度、浓度和孵育时间都会影响RNAi对虫体的干扰效果和Vip3Aa的毒力。 综上所述，本研究发现PHB2对Vip3Aa来说是一个双功能蛋白，它既是Vip3Aa蛋白的受体，也能够通过线粒体途径抑制Vip3Aa诱导的细胞凋亡，后者比前者对Vip3Aa的毒力更加重要。actVip3Aa可以通过入胞、成孔、诱导凋亡来发挥毒力。Vip3Aa与多杀菌素联合使用具有协同杀伤Sf9细胞和草地贪夜蛾幼虫的效果。通过RNAi方法干扰抗凋亡蛋白的表达水平也能够提高Vip3Aa对Sf9细胞和草地贪夜蛾幼虫的毒力。
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