摘要
在结肠癌的发生发展进程中，肿瘤的恶性增殖可能会对机体的肠黏膜屏障造成损害，导致肠上皮屏障功能发生障碍而致有害物质如炎症因子、病原体等进入机体内。同时，治疗结肠癌时常用的化疗药物也会对机体正常细胞造成不同程度的损害。因此，有必要寻找新的治疗方法来实现抗肿瘤的同时达到对肠黏膜的保护作用。本课题以多胺和糖酵解为靶点，采用小檗碱干预下的人结肠癌HCT116细胞与肠上皮IEC6细胞共培养的模式，探讨小檗碱的抗肿瘤效果与肠黏膜保护作用及其可能的分子机制。 研究目的： 明确小檗碱对人结肠癌HCT116细胞与肠上皮IEC6细胞共培养体系中的肠上皮屏障功能具有保护作用；明确小檗碱通过调节HCT116细胞的多胺代谢与转运以及MYC/HIF1糖酵解机制来达到抗肿瘤和保护肠粘膜作用。 研究方法： 1、小檗碱对HCT116和IEC6细胞增殖的影响 使用MTT法检测不同浓度的小檗碱对人结肠癌细胞HCT116与肠上皮细胞IEC6抑制增殖作用的最佳浓度和作用时长；使用流式细胞仪检测小檗碱对HCT116细胞凋亡率的影响。 2、小檗碱对共培养体系中IEC6细胞肠上皮屏障功能的影响 使用被不同浓度的小檗碱干预48小时的HCT116细胞与IEC6细胞共培养，WesternBlot法检测单独培养和共培养体系中的肠上皮细胞IEC6的跨膜蛋白和支架蛋白ZO-1、Occludin及Claudin1的表达变化，同时用Millicell?ERS-2电阻系统和荧光分光光度计检测共培养体系中IEC6细胞层的电阻值和FD4荧光强度。 3、小檗碱对IEC6和HCT116细胞多胺含量及多胺代谢的影响 将被不同浓度的小檗碱干预过的HCT116细胞与IEC6细胞进行共培养。HPLC法检测共培养体系中两种细胞内多胺含量的变化。使用不同浓度的小檗碱和DFMO单独作用于HCT116细胞，WesternBlot法检测HCT116细胞内多胺代谢及转运相关蛋白(ODC、SSAT、OAZ1及SLC22A1)的表达变化。 4、小檗碱对HCT116细胞MYC/HIF1?糖酵解的影响 使用不同浓度的小檗碱和2-DG作用于HCT116细胞，微量法检测HCT116细胞的葡萄糖消耗量、乳酸含量、乳酸脱氢酶含量及ATP含量；WesternBlot法检测HCT116细胞内HIF1?、C-MYC、HK2、PKM2、PDK1、GLUT1以及LDHA等与糖酵解代谢过程相关蛋白的表达变化。 研究结果： 1、小檗碱对HCT116细胞具有明显的抑增殖作用 小檗碱在浓度为0-60μM内对人结肠癌细胞HCT116细胞的增殖有显著的抑制作用，且随着浓度增大和作用时间延长其抑制作用增加；小檗碱在IEC6细胞培养基中作用24h后，对IEC6的增殖抑制作用无统计学意义。与不加小檗碱的对照组相比，加入三种不同浓度的小檗碱后，HCT116细胞的凋亡率逐渐增大。 2、小檗碱对IEC6细胞肠上皮屏障功能具有保护作用 将被不同浓度的小檗碱干预48小时的HCT116细胞与IEC6细胞共培养后，与单培养的IEC6细胞层相比，共培养不加药组的电阻值、FD4荧光强度及紧密连接相关蛋白(ZO-1、Occludin及Claudin1)表达量均下降，而加入小檗碱干预后的共培养体系中IEC6细胞层的电阻值、FD4荧光强度和ZO-1、Occludin及Claudin1均逐渐上升，且呈浓度依赖性。 3、小檗碱调节HCT116与IEC6细胞内多胺含量及多胺代谢水平 与单培养的IEC6细胞对照组相比，共培养不加药组的IEC6细胞内多胺含量下降，加入小檗碱后IEC6细胞内多胺含量逐渐上升；同时，与单培养的HCT116细胞对照组相比，共培养不加药组的HCT116细胞内多胺含量上升，加入小檗碱后HCT116细胞内多胺含量逐渐下降。与不加药的对照组相比，不同浓度的小檗碱可抑制HCT116细胞内多胺合成蛋白ODC的表达，可促进多胺代谢蛋白SSAT及OAZ1的表达，同时，不同浓度的小檗碱可明显抑制HCT116细胞内多胺转运体SLC22A1的表达。 4、小檗碱抑制HCT116细胞的MYC/HIF1α糖酵解通路 与不加药的对照组相比，加入3.75、7.5、15μM浓度的小檗碱可不同程度的减少HCT116细胞的葡萄糖消耗量、乳酸含量、乳酸脱氢酶含量及ATP含量，并呈浓度梯度相关性。与不加药的对照组相比，加入小檗碱干预后，HCT116细胞的原癌基因C-MYC及缺氧诱导因子HIF1?蛋白表达量下降，同时，糖酵解通路的相关蛋白如HK2、PKM2、PDK1、GLUT1以及LDHA蛋白表达量均不同程度地降低。 研究结论： 3.75、7.5、15μM浓度的小檗碱对人结肠癌细胞HCT116有明显的抑增殖作用，且对人结肠癌细胞HCT116与肠上皮细胞IEC6共培养体系中的肠上皮屏障功能具有保护作用。小檗碱可通过抑制肿瘤多胺合成、促进多胺代谢及抑制转运体表达来达到抗肿瘤和保护肠上皮屏障功能的作用。小檗碱还可通过抑制MYC/HIF1?糖酵解通路来达到抑制肿瘤细胞生长的作用。
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