摘要
目的 1.利用经典MCAO/R模型，将黄芪和红花（Huangqi-Honghua，HQ-HH）与临床上治疗脑缺血的药物即脑心通胶囊（Naoxintong，NXT）进行药效对照验证，为进一步证实HQ-HH可改善脑缺血再灌注损伤（CerebralIschemia-reperfusionInjury，CI/RI）的药效作用。 2.通过粪菌移植手段探讨HQ-HH对CI/RI大鼠肠道菌群及其代谢物短链脂肪酸（Shortchainfattyacids,SCFAs）的影响。 3.验证HQ-HH和移植富含HQ-HH粪菌对CI/RI的作用机制，尤其是HQ-HH对CI/RI的引起的炎症反应的干预作用。 方法 1.HQ-HH对CI/RI大鼠的药效作用研究。采用随机数字表法将大鼠随机分为4组：Sham组、Model组、HQ-HH组、NXT组。利用Bederson评分、脑组织含水量、脑梗死体积、脑组织尼式体染色的方法，评估HQ-HH对CI/RI药效作用。 2.HQ-HH对CI/RI大鼠的肠道菌群及其代谢物研究。采用随机数字表法将大鼠随机分为4组：Sham组、Model组、HQ-HH组、FMT组。首先用Bederson评分、脑梗死体积、脑组织病理染色评价FMT药效作用；然后利用16srRNA测序分析各组肠道菌群变化；最后利用GC/MS检测粪便、血清、脑组织中的肠道菌群代谢物SCFAs含量变化。 3.HQ-HH通过“脑肠轴”改善CI/RI的作用机制研究。①利用肠组织病理切片、PAS染色法和Elisa法评价HQ-HH和FMT对肠屏障的作用。②利用免疫组化观察脑组织紧密连接蛋白的表达评价HQ-HH和FMT对血脑屏障的作用。③利用免疫组化和Westernblot分别检测肠组织和脑组织中SCFAs受体蛋白的表达。④利用Westernblot检测脑组织中炎症相关因子蛋白的表达水平，并利用免疫荧光观察M1/M2小胶质细胞的极化情况。 结果 1.HQ-HH对CI/RI大鼠的药效作用研究。①Bederson评分结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和NXT组大鼠神经功能评分显著降低（Plt;0.01）；②脑组织含水量结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和NXT组大鼠脑组织含水量显著降低（Plt;0.01）；③脑梗死体积结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和NXT组大鼠脑组织梗死体积显著降低（Plt;0.01）；④Nissl染色结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和NXT组尼式体数量明显增加，染色加深，尼式体形状清晰，间隙减小。 2.HQ-HH对CI/RI大鼠的肠道菌群及其代谢物研究。①Bederson评分结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组大鼠神经功能评分显著降低（Plt;0.01）；②脑梗死体积结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组大鼠脑组织梗死体积显著降低（Plt;0.01）；③HE染色结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组神经元细胞核固缩减少，细胞间隙变小，神经元损伤、坏死低于Model组；④抗生素清除原始肠道菌群结果表明：经检测样本中细菌的拷贝数发现，与SPF组相比，使用抗生素后的PGF组的细菌清除率达到90%以上；⑤肠道菌群结果表明：HQ-HH组和FMT组均能改变大鼠CI/RI导致的ɑ-多样性降低，β-多样性增加。物种组成上，与Model组相比，HQ-HH组和FMT组在门水平上Firmicutes增加、Bacteroidota降低；在属水平上有益菌增加，有害菌降低；⑥SCFAs含量检测结果表明：粪便SCFAs：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组大鼠粪便中的SCFAs含量增加，其中丙酸、丁酸和异丁酸含量明显增加，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。血清SCFAs：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组大鼠粪便中的SCFAs含量增加，其中丙酸、丁酸和异丁酸含量明显增加，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。脑组织SCFAs：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组大鼠粪便中的SCFAs含量增加，其中丁酸和己酸含量明显增加，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。 3.HQ-HH通过“脑肠轴”改善CI/RI的作用机制研究；①肠组织HE染色结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组状细胞数量减少程度、组织结构破坏情况、局部坏死和炎性浸润明显低于Model组，损伤明显好转；②杯状细胞PAS染色结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组紫红色的杯状细胞数量明显增多，杯状细胞形态趋于正常；③肠屏障检测结果表明：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组LPS、LBP和D-Lac明显下调（Plt;0.01）；④肠组织和脑组织中SCFAs受体水平结果：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组SCFAs受体GPR41、GPR43和GPR109A表达明显升高（Plt;0.01）；⑤血脑屏障检测结果：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组紧密连接蛋白ZO-1、Ocludin和Claudin-5明显升高（Plt;0.01）；⑥脑组织炎症因子检测结果：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α显著降低（Plt;0.01），抗炎因子IL-10和TGF-β显著增加（Plt;0.01）；⑦脑组织小胶质细胞M1/M2型表达：与Model组相比，HQ-HH组和FMT组M1型小胶质细胞显著降低，M2型小胶质细胞显著增加。 结论 1.通过药效实验进一步证明了HQ-HH对CI/RI的有效作用。 2.利用粪菌移植技术验证了肠道菌群在HQ-HH发挥脑保护过程中的重要作用。并通过对肠道菌群及其代谢物分析发现，HQ-HH可以通过改变CI/RI肠道菌群的结构变化和物种组成，增加有益菌，减少有害菌的方式调控CI/RI导致的肠道菌群失调。进一步对物种组成分析发现，肠道菌群差异菌属与肠道菌群代谢物SCFAs呈密切相关性。对SCFAs进行分析发现，HQ-HH可以调控CI/RI导致体内的肠道菌群及其代谢物SCFAs代谢的紊乱。 3.HQ-HH可以调控肠道菌，激活SCFAs受体，维持SCFAs稳态，增加上皮屏障功能，减少肠道代谢物和内毒素产生，并抑制小胶质细胞向M1型极化并促进其向M2型极化，降低脑内炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α，增加抗炎因子IL-10和TGF-β减轻脑部炎症增强大脑防御功能，从而改善CI/RI。
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