摘要
研究背景： 据统计，全世界每8对育龄夫妇中就有1对患不孕不育症，育龄期女性肿瘤患者治疗后生育力保存作为不孕不育治疗领域的新型分支，其重要性逐渐受到重视。作为肿瘤治疗中的重要方案，化疗常常导致卵巢损伤，即化疗所致早发性卵巢功能不全(prematureovarianinsufficiency,POI)，严重影响年轻女性患者的内分泌及生殖能力。针对于改善内分泌情况的激素替代治疗(hormonereplacementtherapy,HRT)虽然可缓解围绝经期症状，但不能防止其发生和进展。而美国生殖医学协会(AmericanSocietyforReproductiveMedicine,ASRM)推荐的生育力保存方式，仅有胚胎和成熟卵的冻存。因此为POI患者找到一种新的临床治疗策略显得尤为迫切。 近年研究发现卵巢组织、干细胞及其外泌体移植可以部分或完全恢复化疗所致POI。其中自体冷冻卵巢组织移植是保存女性生育能力的有效手段，但是面临移植手术难度大、移植卵巢组织活力有限等问题。干细胞来源的外泌体以及外泌体转运的microRNA(miRNA)为POI的诊治提供了新思路，即“无细胞”治疗策略。相较于目前研究较多的干细胞来源外泌体及miRNA，卵巢组织来源的外泌体及miRNA更安全、更准确、更高效，避免了干细胞来源外泌体及miRNA的相关缺点。 研究证实，卵巢颗粒细胞大量凋亡导致卵泡闭锁。因此，本研究就卵巢组织来源外泌体及miRNA是否改善卵巢颗粒细胞的凋亡进行探讨。我们拟采用临床上常用的化疗药物环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)来诱导小鼠POI模型及颗粒细胞损伤模型，通过体内、外实验研究卵巢组织来源外泌体及miRNA对CTX导致的卵巢颗粒细胞凋亡是否具有保护作用，为外泌体及miRNA治疗POI提供实验基础。 研究目的： 本课题以化疗性POI小鼠为模型，检测卵巢组织外泌体中miRNA的差异表达，研究miR-122-5p对卵巢颗粒细胞的影响，探讨miR-122-5p在POI发病过程中的作用机制。 研究方法： 1.POI小鼠模型构建：ICR小鼠腹腔注射CTX及白消安2周，取双侧卵巢组织，培养后收集上清液。超高速离心法提取外泌体并鉴定。 2.卵巢组织来源外泌体对CTX诱导卵巢颗粒细胞凋亡的影响：将卵巢颗粒细胞分为对照组和CTX组，CTX组又分为正常外泌体组(CTX+Exos-NC)、POI外泌体组(CTX+Exos-POI)；外泌体与卵巢颗粒细胞共培养，流式细胞仪(Fluorescence-activatedcellsorting,FACS)检测各组颗粒细胞的凋亡。 3.正常及POI小鼠外泌体miRNA高通量测序，qPCR、Westernblot及免疫组化检测外泌体miRNA和卵巢组织中相关基因的表达。 4.miR-122-5p对卵巢颗粒细胞凋亡的影响：卵巢颗粒细胞分为对照组和CTX组，CTX组加入2μMCTX；将CTX组再设置4个组，即CTX+miR-122-5pmimicNC组、CTX+miR-122-5pmimic组、CTX+miR-122-5pinhibitorNC组、CTX+miR-122-5pinhibitor组。FACS检测各组小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡情况。qPCR、Westernblot检测miRNA和卵巢组织中相关基因的表达。 研究结果： 1.成功构建POI小鼠模型，卵巢HE染色显示卵巢组织中闭锁卵泡增多。提取的外泌体呈淡黄色絮状沉淀；电子显微镜观察，外泌体呈圆形或椭圆形的双层膜性囊泡；外泌体表面特异性标志蛋白CD63和CD81呈阳性。 2.外泌体对颗粒细胞凋亡的影响。正常卵巢组织来源的外泌体，可显著抑制CTX诱导的卵巢颗粒细胞凋亡(Plt;0.01)。 3.小鼠卵巢外泌体高通量测序结果显示上调和下调超过两倍的miRNA有30个，miR-122-5p在POI组卵巢外泌体中上调超过32倍，其靶基因BCL9在化疗性POI卵巢组织中表达明显下调(Plt;0.01)。 4.miR-122-5pmimic促进CTX诱导的卵巢颗粒细胞的凋亡，miR-122-5pinhibitor通过上调BCL9减少CTX诱导的卵巢颗粒细胞凋亡(Plt;0.001)。 结论： 正常卵巢组织来源外泌体及miR-122-5pinhibitor通过靶向调节BCL9减弱CTX诱导的卵巢颗粒细胞凋亡，促进化疗所致POI卵巢功能的修复。
NETL