摘要
现有的重组蛋白原核生物表达系统都或多或少的存在着缺陷，限制了它们在重组蛋白工业生产上的应用。谷氨酸棒杆菌是一种十分优异的适用于外源蛋白表达的宿主菌。目前存在的谷氨酸棒杆菌表达载体都是以抗生素抗性作为筛选标记，诱导型表达载体多以IPTG为诱导剂，IPTG价格昂贵，且具有一定的细胞毒性，使该类表达载体应用于重组蛋白工业化生产方面具有很大的局限性，尤其不适用于食品酶制剂生产。重组蛋白的胞外分泌表达可以简化纯化步骤，降低酶制剂的工业化生产成本。因此,发展适用于重组蛋白工业化生产的新型高效谷氨酸棒杆菌重组蛋白分泌型表达系统是非常有必要的。就高效表达系统的创建而言，一方面需要对宿主菌株进行特定遗传改造，另一方面需要构建高效表达载体。理想的诱导型表达载体需要使用由强启动子与负调控系统操作子序列组成的“强启动子-操作子”杂合转录调控区。本研究应用CRISPR-Cpf1基因编辑技术对谷氨酸棒杆菌进行了遗传改造，同时构建了一系列新型谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效分泌型表达载体，创建了由工程宿主菌-表达载体组成的新型高效谷氨酸棒杆菌重组蛋白分泌型表达系统。以来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的α-淀粉酶基因amyF作为报告基因，对构建的谷氨酸棒杆菌重组蛋白分泌型表达系统的实用性进行了验证。本研究的主要研究成果如下: (1)以本实验室前期构建的基础穿梭载体pAU2为出发点质粒，构建了包含T7RNA聚合酶基因T7gene1的卡那霉素抗性标记中间载体pAU29K; (2)以pAU29K为基础，构建了携带有包含tacM-T7双启动子和Sac型强信号肽cgR_2070的人工合成的克隆/表达盒S-Box1的抗性标记高效分泌型组成型表达载体pAU29KS,以及携带有包含tacM-T7双启动子和Tat型强信号肽cgR_0904的人工合成的克隆/表达盒T-Box1的抗性标记高效分泌型组成型表达载体pAU29KT;以来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的α-淀粉酶编码基因amyF作为报告基因，证明了基于tacM强启动子-谷氨酸棒杆菌自身RNA聚合酶和基于T7启动子-T7RNA聚合酶互作的双转录系统和Sac型强信号肽cgR_2070以及Tat型强信号肽cgR_0904应用于谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效分泌表达系统构建的可行性; (3)基于CRISPR-Cpf1基因编辑技术，构建了谷氨酸棒杆菌基因组丙氨酸消旋酶基因alr缺失，同时插入来源于枯草芽孢杆菌的阿拉伯糖透过酶基因araE的突变株C.glutamicum△alr∷araE,发现以alr为互补型筛选标记的C.glutamicum△alr∷araE△murI,murI基因的缺失优化了alr互补型筛选标记载体的谷氨酸棒杆菌转化子筛选工作。 (4)以本实验室前期构建的基础穿梭载体pAU28为出发点质粒，构建了包含T7RNA聚合酶基因T7gene1、alr基因为互补型筛选标记的中间载体pAU29,并在pAU29基础上构建了包含枯草芽孢杆菌L-阿拉伯糖操纵元负调控系统阻遏蛋白编码基因araR的互补型中间载体pAU30; (5)以pAU29为基础，构建了携带有包含tacM-T7双启动子和Sac型强信号肽cgR_2070的人工合成的克隆/表达盒S-Box1的新型高效分泌型组成型表达载体pAU29CS,以及包含tacM-T7双启动子系统和和Tat型强信号肽cgR_0904的人工合成的克隆/表达盒T-Box1的新型高效分泌型组成型表达载体pAU29CT;并以α-淀粉酶编码基因amyF作为报告基因，证明了基于互补型筛选标记的谷氨酸棒杆菌新型高效分泌型组成型表达系统的可用性。 (6)以pAU30为基础，构建了携带有包含tacM-T7双启动子、Sac型强信号肽cgR_2070以及来源于B.subtilis的阿拉伯糖操纵元负调控系统的araO操作子的人工合成的克隆/表达盒S-Box2的新型高效分泌型诱导型表达载体pAU30S,以及包含tacM-T7双启动子、Tat型强信号肽cgR_0904以及araO操作子的人工合成的克隆/表达盒T-Box2的新型高效分泌型组成型表达载体pAU30T;以α-淀粉酶编码基因amyF作为报告基因，证明了基于互补型筛选标记的谷氨酸棒杆菌新型高效分泌型诱导型表达系统的可用性。
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