摘要
四季秋海棠（Begonia semperflorens）是秋海棠科（Begoniaceae）秋海棠属（Begonia）多年生常绿草本，绿叶系列‘超级奥林匹克’（‘Super Olympia’）对环境胁迫的响应和适应导致叶片花色素苷积累过量而呈色变红，适于研究活性氧（reactive oxygen species，ROS）诱导花色素苷合成机制。ROS在环境因子诱导花色素苷合成中起重要作用，植物NADPH氧化酶（Respiratory Burst Oxidase Homologues，RBOHs）是植物细胞内ROS的主要生产者，在植物防御反应、生长发育调节和细胞信号转导等方面具有重要作用。ROS作为氧代谢的天然副产物参与细胞信号转导和体内平衡，其过量累积则严重损害植物细胞结构。因此，探明植物对胁迫响应中的Rboh依赖机制成为迫切需要。 课题组前期研究发现，异源表达BsRbohD产生的ROS爆发能诱导拟南芥叶片花色素苷合成。为了进一步确认BsRbohD产生的ROS爆发对四季秋海棠花色素苷合成的诱导机理，本研究构建BsRbohD干扰表达（RNAi）载体，分别将干扰载体和空载体转化四季秋海棠；以野生型和空载四季秋海棠为对照，进行低温处理，检测野生型、空载、三个干扰株系RNAi1、RNAi2和RNAi3与三个过表达株系OE1、OE2和OE3的活性氧与花色素苷含量，BsRbohD与花色素苷合成相关基因表达量；通过转录组测序筛选差异表达基因。主要研究结果如下： 1.构建BsRbohD干扰表达载体，通过农杆菌介导的叶盘法转化四季秋海棠，经抗性筛选与转录水平鉴定选出干扰株系RNAi1、RNAi2和RNAi3与空载株系EV1。对低温（昼15℃/夜5℃）下各株系进行表型观察发现，三个过表达株系叶片变红程度明显高于对照植株，而三个干扰株系叶片仅表现出轻微变化，花色素苷含量测定结果与此一致。表明相较于对照株系，过表达BsRbohD后植株叶片产生了更高的花色素苷积累，干扰植株叶片花色素苷积累则较少。 2.分别测定低温0-6d时所有株系叶片超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量。结果显示，正常条件下九个株系活性氧含量差异不显著，而后三个过表达株系活性氧含量显著高于对照植株，干扰株系则低于后者，组织化学染色结果表现出类似趋势。这表明BsRbohD基因所编码的NADPH氧化酶低温下被激活并正常行使功能，且过表达该基因能增加ROS产物使过表达植株较对照植株显示出对环境变化更强的响应能力，而干扰植株则反之。 3.实时荧光定量PCR分析显示，BsRbohD表达上调后，花色素苷合成相关基因表达也随之上调，过表达株系各基因表达量几乎均显著高于对照植株，干扰株系各基因表达量则反之。这表明在四季秋海棠中BsRbohD过表达能显著增加花色素苷生物合成相关基因表达量，进而促进花色素苷的生物合成，在四季秋海棠中干扰BsRbohD后则反之。 4.转录组学分析显示，DEGs主要富集在类黄酮生物合成途径、乙烯激活信号负调节通路和过氧化氢反应通路中。类黄酮生物合成途径分析表明结构基因CHS、DFR通过与MYB、bHLH、NAC等转录因子结合共同调控四季秋海棠花色素苷的合成；乙烯激活信号负调节通路中筛选到5个显著下调的ERF基因，表明乙烯响应因子ERF参与调控ROS产生进而调控花色素苷的生物合成；过氧化氢反应通路中筛选到3个WRKY转录因子，2个bHLH转录因子和3个ERF转录因子，均随BsRbohD的上调而显著上调表达。以上结果表明，BsRbohD上调表达引发ROS爆发，H2O2作为信号分子调节花色素苷相关调控基因的表达，引起花色素苷相关结构基因表达上调，最终导致四季秋海棠花色素苷积累。
NETL