摘要
油茶是我国重要的木本食用油料植物，同化物的卸载是决定其产量的关键因素之一。在油茶果实中，韧皮部的卸载途径会随着果实的发育而在质外体途径和共质体途径之间转换，然而，韧皮部卸载途径转换的分子机制在很大程度上仍是未知的。蔗糖转运蛋白SUTs是一种跨膜转运糖的载体蛋白，位于细胞膜或亚细胞器膜上，广泛参与库器官处糖的韧皮部卸载和吸收转运，从而调控植株的糖积累和分配。因此，蔗糖转运蛋白对于调控油茶果实同化物的积累和产量形成具有重要意义。本研究以油茶品种‘华硕’为研究对象，结合油茶果实在不同发育时期的生理生化变化，利用RNA-seq技术分析了油茶果实在两个不同卸载阶段，即授粉后260天（八月中旬）和授粉后290天（九月中旬）的潜在分子调控网络，鉴定出重要的卸载调控途径和关键基因，解析了油茶果实卸载方式转变的潜在分子机制。根据差异基因分析和相关性网络分析等转录组分析结果，筛选出油茶卸载关键基因SUT蔗糖转运蛋白家族，对其进行了生物信息学分析和表达特性分析，并克隆了三个重要的CoSUTs基因，通过亚细胞定位，酵母功能互补验证、转化苹果果肉愈伤及拟南芥等遗传材料探究了基因的特性和基本生物学功能，验证了其在糖卸载和积累中的关键作用，为进一步揭示果实糖卸载和积累机制，提高油茶等经济作物的产量和品质提供了理论基础和技术支持。本研究主要取得以下结果: 1.与发育中期（260DAP）相比，油茶果实在发育后期（290DAP）的韧皮部CF荧光运输路径由主维管束部位扩散到韧皮部周围薄壁细胞，韧皮部周围细胞的胼胝质含量也下降了近50％,显示果实卸载路径由质外体卸载途径转变为共质体卸载途径。与此同时，果实中可溶性糖、蔗糖、淀粉以及油脂等有机化合物含量在果实发育后期均显著升高。其中，果实可溶性糖含量较果实发育中期上升了 27％,种子中的可溶性糖、蔗糖、淀粉和油脂含量则比发育中期分别上升了 79％、290％、71％和240％。 2.转录组测序分析表明，在油茶果皮和种子中分别有2615和2747个差异表达的基因，对这些差异基因进行GO和KEGG富集分析，发现这些差异基因主要被富集在包括“细胞壁成分”、“质外体”和“质膜固定成分”等细胞成分以及“生长素激活信号通路”、“细胞壁多糖代谢”、“淀粉和蔗糖代谢”以及“脂肪代谢”等生物过程和代谢过程中。 3.通过转录组差异基因表达分析和差异转录因子基因共表达网络分析，进一步筛选出几个参与调节油茶果实韧皮部糖卸载的关键候选基因，包括SUT8、CALS10、PDBG11、PDBG14、CWIN4基因，确定了 SUT8在这些候选基因中的核心地位。 4.从本次转录组数据库中筛选出6个SUT蔗糖转运蛋白家族基因，这6个CoSUTs基因被分为三个亚家族，在结构上都包含一个关键的SUT基因类结构域GPH_sucrose superfamily。6个CoSUTs基因在油茶果实的各个发育阶段呈现出不同的基因表达模式。总体而言，CoSUT1、CoSUT4和CoSUT8基因在油茶果实中的表达量最高。结合已发表的油茶基因组数据库，对CoSUT4基因的启动子顺式作用元件进行分析表明，CoSUT4基因的启动子序列上包括多个激素响应元件、多个非生物胁迫响应元件等。 5.从油茶果实中克隆了三个与果实糖卸载相关的蔗糖转运蛋白基因的完整编码序列，其中CoSUT4的编码序列长度为1509 bp，编码503个氨基酸;CoSUT8包括一个738 bp的ORF,编码246个氨基酸;CoSUT1包括一个1563 bp的ORF,编码520个氨基酸。CoSUT1基因在油茶根、果实和种子中的表达量最高;CoSUT8基因在油茶茎、果实和种子中的表达量最高;除了在成熟叶中高表达外，CoSUT4基因在油茶成熟叶片、茎、幼叶以及果实中的表达量较高。 6.烟草叶片亚细胞定位发现，油茶三个蔗糖转运蛋白CoSUT4、CoSUT8和CoSUT1均定位于细胞质膜。经酵母缺陷互补实验证明，这三个蔗糖转运蛋白均具有吸收转运蔗糖的功能活性。经油茶胚珠体外诱导实验发现，CoSUT4对ABA、MeJA和乙烯有明显响应，CoSUT8对ABA有明显响应。 7.分别获得了CoSUT4和CoSUT8恢复的纯合拟南芥同源基因突变体。CoSUT4在拟南芥中的同源基因突变体表现为种子萌发率降低，幼苗根长缩短，成苗株高降低、结果量下降、千粒重降低。CoSUT4在拟南芥中的表达使拟南芥同源突变体的缺陷表型得到恢复，同时也恢复了突变体植株蔗糖、淀粉含量以及种子油脂含量降低的生理缺陷表型。此外，CoSUT4的表达也提高了同源突变体拟南芥植株在盐和干旱胁迫下可溶性糖含量的积累，增强了突变体植株应对盐胁迫和干旱胁迫的能力。而CoSUT8的异源表达亦能恢复拟南芥同源突变体株系中幼苗根长缩短、结果量下降、千粒重降低，植株蔗糖、淀粉含量以及种子含油量下降等生长和产量缺陷表型。 8.获得了 CoSUT4和CoSUT1过量表达的“王林”苹果愈伤组织。CoSUT4转基因愈伤组织在培养基上生长量较普通愈伤组织增加了 25％;CoSUT1转基因愈伤组织中蔗糖含量较对照提高了 22％。此外，CoSUT4基因还促进了愈伤组织在模拟盐和干旱胁迫培养基上的生长。
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