摘要
帕金森病(Parkinson''s Disease,PD)是一种常见于中老年人的神经退行性疾病，临床症状包括早期出现的嗅觉障碍、胃肠道功能紊乱等非运动症状。晚期伴有典型的运动症状，包括静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势不稳等。PD的主要病理变化包括中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失以及残存神经元胞体中出现路易体(Lewy bodies,LBs),而LBs的主要成分是α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)。由于该病病因及发病机制复杂，现阶段仍缺乏有效的诊断和治疗方法。在病理情况下，PD患者脑组织内在丝氨酸(Serine,Ser)129位点发生磷酸化修饰的α-syn(pSer 129 α-syn,p-α-syn)占总α-syn的比例异常升高，从生理情况下的4％上升到90％以上。虽然有文献报道，Ser 129位点的磷酸化修饰在α-syn聚集、病理传播、介导细胞毒性等方面都发挥作用，但具体机制仍不清楚。 基于以上研究背景，在本课题的第一部分，我们利用体外蛋白实验及细胞实验，检测Ser 129位点的磷酸化修饰在α-syn聚集、病理传播、介导细胞毒性方面发挥的作用。首先在体外制备相关蛋白，包括:人源α-syn(human α-syn,h-α-syn)及 p-α-syn 单体、四氧代壬烯醛(4-oxo-2-nonenal,ONE)诱导的 h-α-syn 聚集体(ONE-induced wild type h-α-syn，OW)及 p-α-syn 聚集体(ONE-induced p-α-syn,OP)、α-syn 预制原纤维(α-syn preformed fibrils,PFF)、Ser 129 位点磷酸化修饰的α-syn预制原纤维(phosphorylated PFF,pPFF)。随后利用透射电镜观察、硫磺素S染色、Western bolt、蛋白酶K抗性实验检测上述蛋白在结构及生化特性上的差异。并通过将上述蛋白外加到小鼠皮层原代神经元的方法，评估各组受体细胞病理性p-α-syn诱导的差异。我们进一步在SH-SY5Y细胞水平评估Ser 129位点的磷酸化修饰对α-syn聚集及细胞毒性的影响。实验结果显示:①Ser 129位点的磷酸化修饰促进α-syn在聚集过程中β片层结构的形成;OP及pPFF聚集体中β片层含量高于在Ser 129位点未发生磷酸化修饰的OW、PFF聚集体;② 虽然OW及OP的纤维密度低于PFF及pPFF聚集体，但OW及OP的稳定性及蛋白酶K抗性高于PFF及pPFF聚集体;③h-α-syn、p-α-syn、OW、OP、PFF及pPFF聚集体处理后小鼠皮层原代皮层神经元中都出现了 p-α-syn异常升高的受体神经元。但在p-α-syn及OP处理组的受影响神经元中，p-α-syn病理阳性染色集中分布在细胞膜上;④在SH-SY5Y细胞中，Ser 129位点的磷酸化修饰对α-syn聚集及细胞毒性具有促进作用。 尽管目前有很多针对α-syn在PD发病过程中致病机制的研究，但是有关p-α-syn所介导的致病机制研究较少。为了鉴定出与α-syn及p-α-syn相互作用存在差异的蛋白，在本课题研究的第二部分，我们利用免疫共沉淀实验结合质谱分析技术(Co-Immunoprecipitation/Mass Spectrometer,CO-IP/MS)，检测并鉴定在 h-α-syn 转基因小鼠(Thy1-SNCA transgenic mice,Tg)中脑脑组织中与 p-α-syn 及h-α-syn相互作用的未知蛋白，并对与p-α-syn存在相互作用的蛋白进行GO及KEGG的生物信息学分析。我们进一步利用免疫胶体金标记实验检测Tg小鼠中脑神经元中p-α-syn的亚细胞定位。接着我们对MS结果中与p-α-syn及h-α-syn相互作用存在差异的蛋白按照Peptides(95％)排序，并对排名第一位的蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白 51(Protein tyrosine phosphatase interacting protein 51,PTPIP51),以及排名第七位的囊泡相关膜蛋白相关蛋白(Vesicle-associated membrane protein-associated protein,VAPB)进行验证。文献报道，定位在内质网膜上的VAPB与定位在线粒体膜上的PTPIP51在线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes,MAM)中起到“脚手架”的作用,并且参与内质网及线粒体之间钙离子调控。因此我们进一步评估了α-syn及其在Ser 129位点的磷酸化修饰对内质网及线粒体中钙离子的调控作用。我们的实验结果显示:①在Tg小鼠中脑脑组织中，Ser 129位点的磷酸化修饰会部分影响α-syn与相关蛋白之间的相互作用;②神经元中p-α-syn主要分布于细胞骨架、细胞质、细胞核、突触、线粒体、内质网、MAM;③Ser 129位点的磷酸化修饰在h-α-syn与VAPB及PTPIP51之间相互作用中起到必要调节作用;④在SH-SY5Y细胞中，抑制Ser 129位点的磷酸化修饰可缓解由于α-syn过表达所造成的内质网及线粒体钙离子超载。 针对PD患者外周血液样本中p-α-syn检测的研究发现，血液中p-α-syn有望成为PD早期诊断及反映疾病发生发展的外周生物标志物。但是由于目前缺乏权威的p-α-syn检测方法，相关的研究还有待于进一步验证。在本研究的第三部分，我们在文献及实验室前期研究的基础上，制备并筛选出特异性识别p-α-syn的鼠源单克隆抗体C140S，此抗体不仅特异性地识别体外制备的p-α-syn单体及聚集体，而且特异性地识别α-syn病理传播模型及Tg小鼠中脑脑组织中病理性p-α-syn聚集体，且与市售p-α-syn抗体的识别效果一致。接着在第四部分的研究中，我们利用免疫学相关技术，检测Tg小鼠及PD患者中脑脑组织及外周血液中p-α-syn的分布情况。实验结果显示:①Tg小鼠及PD患者中脑血脑屏障周围存在p-α-syn的分布;②PD患者外周血浆及血细胞中存在p-α-syn蛋白。由于目前缺乏统一的p-α-syn检测方法，在本课题的第五部分实验中，我们在实验室前期研究的基础上，继续验证SN16-C140S双抗夹心ELISA的特异性。结果显示，此方法可以特异性地识别体外制备的p-α-syn单体及聚集体。将SN16-C140S双抗夹心ELISA应用于细胞上清及小鼠血浆中p-α-syn的检测实验，结果显示:①h-α-syn及p-α-syn都可以被SH-SY5Y细胞分泌到上清中;②Tg小鼠外周血浆中存在异常升高的p-α-syn。 综上所述，在本研究中我们首先利用体外蛋白实验检测Ser 129位点的磷酸化修饰在α-syn聚集、病理传播、介导细胞毒性方面发挥的作用。随后利用Tg小鼠检测与h-α-syn及p-α-syn相互作用存在差异的蛋白，进一步探究Ser 129位点磷酸化修饰对α-syn相互作用蛋白及功能的影响。同时在实验室前期研究的基础上，我们进一步验证了 p-α-syn鼠源单克隆抗体C140S及SN16-C140S双抗夹心ELISA的特异性，为检测p-α-syn及探究其在PD中的致病机制提供了有力的技术支持。
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