摘要
缺血性卒中是高发病率、高致残率和高致死率的脑血管病，由于其病理生理机制复杂，限制了治疗措施的研究进展。激活素A为转化生长因子β超家族成员，在缺血再灌神经细胞损伤中发挥重要作用，同时本实验室前期研究发现激活素A可以促进脑白质再髓鞘化，但其对缺血性卒中后神经元保护的确切分子机制尚不清楚。自噬在缺血性卒中后神经元损伤中的作用呈现两面性，适度自噬有益于神经元正常生理功能，过度自噬则会导致神经元死亡。近期研究发现，cGAS-STING通路是介导自噬的始动因素，在缺血性卒中发生发展中主要起加重损伤作用。然而，目前cGAS-STING通路对于皮层神经元自噬的研究还未见报道。本研究通过在体大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R,middle cerebral arteryocclusion/reperfusion)致缺血性脑卒中小鼠模型和离体原代培养小鼠皮层神经元氧-葡萄糖剥夺/复糖复氧(OGD/R,oxygen-glucose deprivation/reoxygenation)致细胞缺血模型，探讨激活素A对缺血性卒中小鼠脑内神经元保护作用及其通过cGAS-STING通路介导自噬机制。所获实验结果如下: 1.激活素A蛋白在缺血性脑卒中小鼠脑缺血半影区内表达水平上调，并通过抑制自噬水平提高原代皮层神经元存活率 为了研究激活素A在缺血性卒中小鼠神经元损伤中作用，用Western blot方法检测了缺血皮层半影区激活素A表达情况。结果显示，激活素A在1h MCAO模型小鼠，再灌注12小时升高[F(5,30)=12.98,p=0.0331,每组n=6],再灌注24小时达到高峰[F(5,30)=12.98,p＜0.001,每组n=6]。在离体培养原代皮层神经元1h OGD/R24h模型模拟细胞缺血损伤实验中，浓度为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL激活素A明显改善[F(6,70)=6.507,p＜0.01或p＜0.001，每组n=6]OGD/R组神经元存活率。实验室前期结果已经证实，缺血再灌注损伤激活了凋亡和自噬两条通路，1h OGD/R24h处理的原代皮层神经元自噬水平过度激活，对神经元产生损伤作用。 2.激活素A通过调控PI3K-PKB通路抑制OGD/R处理的原代皮层神经元过度自噬 为了进一步探索激活素A抑制1h OGD/R24h处理的原代皮层神经元自噬水平的分子机制，检测了经典调控自噬通路PI3K-PKB通路，结果显示，激活素A明显增加1h OGD/R24h处理的原代皮层神经元PI3K和PKB磷酸化水平[F(5,30)=5.710,p＜0.001;F(5,30)=10.79,p＜0.001,每组n=6],PI3K抑制剂能够逆转激活素A对于OGD/R诱导的LC3转化[F(3,20)=11.76,p=0.0011,每组n=6]、p62降解[F(3,20)=9.248,p=0.0025,每组n=6]以及LC3阳性自噬斑点聚集[F(3,20)=5.078,p＜0.001,每组n=6]的抑制作用。提示激活素A通过调控PI3K-PKB通路抑制1h OGD/R24h原代皮层神经元自噬水平。 3.激活素A通过负向调控非经典途径cGAS-STING轴抑制1h OGD/R24h处理的原代皮层神经元自噬并提高神经元存活率 PI3K-PKB下游通路包括经典通路mTOR以及cGAS。检测了1h OGD/R24h原代皮层神经元mTOR磷酸化水平，结果显示激活素A不通过经典的mTOR途径调控1hOGD/R24h神经元自噬。观察到OGD/R诱导cGAS-STING通路激活，即cGAS活性增强[F(5,30)=108.9,p＜0.001,每组n=6]以及STING磷酸化水平增强[F(5,30)=89.6,p＜0.001,每组n=6]，而且对原代皮层神经元有损伤作用[F(3,40)=14.53,p＜0.001,每组n=6],激活素A可以抑制cGAS活性(p＜0.001)以及STING磷酸化水平(p＜0.001)。进一步使用STING激活剂cGAMP处理原代细胞，发现，cGAMP逆转了激活素A对于OGD/R诱导的LC3转化[F(3,20)=8.278,p=0.0067,每组n=6]、p62降解[F(3,20)=12.21,p＜0.001,每组n=6]以及LC3阳性自噬斑点聚集的抑制作用[F(3,20)=19.69,p=0.0021,每组n=6],而且cGAS抑制剂逆转了激活素A对于原代皮层神经元的存活率的保护作用(p＜0.001)。有趣的是，通过免疫荧光观察到自噬相关基因ATG5在OGD/R后表达增多，且与LC3共定位增多，激活素A可以抑制其表达以及ATG5与LC3共定位[F(2,6)=131.44,p=0.0032,每组n=3]。以上结果表明激活素A通过非经典途径cGAS-STING轴调控OGD/R原代皮层神经元过度自噬并提高神经元存活率。 4.激活素A通过激活PI3K-PKB信号抑制cGAS-STING通路进一步抑制1h OGD/R24h处理的原代皮层神经元自噬水平 通过以上研究观察到激活素A可以通过促进PI3K-PKB,以及抑制cGAS-STING通路调控OGD/R诱导的神经元自噬。为了进一步验证其中的上下游关系，使用PI3K抑制剂观察了cGAS-STING通路变化。结果显示:抑制PI3K能够逆转激活素A对PKB磷酸化水平[F(3,20)=6.590,p＜0.01,每组n=6]、cGAMP含量[F(3,20)=61.82,p＜0.001,每组n=6]以及STING磷酸化水平[F(3,20)=11.53,p=0.0085,每组n=6]的作用。而抑制cGAS不能改变激活素A对1hOGD/R24h处理的原代皮层神经元PKB的磷酸化水平的影响。表明激活素A通过促进PI3K-PKB通路进一步抑制cGAS-STING通路。 5.激活素A通过激活PI3K-PKB通路抑制cGAS-STING信号调控大脑皮层的自噬水平减轻小鼠缺血再灌注后脑损伤 接下来于在体水平验证以上通路，发现，激活素A抑制1h MCAO/R24h小鼠大脑皮层自噬水平。抑制PI3K能够逆转激活素A对于1h MCAO/R24h处理的小鼠大脑皮层PKB磷酸化水平[F(3,20)=12.01,p=0.0018,每组n=6]促进作用以及cGAS活性、STING磷酸化水平[F(3,20)=3.666,F(3,20)=4.519,p＜0.01,每组n=6]的抑制作用。由此可见，激活素A通过激活PI3K-PKB抑制1h MCAO/R24h小鼠大脑皮层cGAS-STING信号通路，并且改善小鼠神经功能。 6.激活素A通过其ACVR1C受体抑制1h MCAO/R24h小鼠大脑皮层自噬水平进而缩小其梗死面积 通过Acvr1cfl/fl;Nestincre/+小鼠体系构建了ACVR1C-/-小鼠，特异性敲除了神经元上的ACVR1C受体，通过Western blot、免疫荧光、以及透射电镜等方法观察受体敲除后对于小鼠病理的影响以及对于激活素A作用的影响。结果表明，特异性敲除神经元上ACVR1C受体可以使1h MCAO/R24h小鼠大脑皮层LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化增强[F(3,20)=48.64,p=0.0443,每组n=6]，自噬小体数量增多[F(3,76)=45.23,p=0.0143,每组n=5]。还观察到，侧脑室注射激活素A可以有效减少野生型小鼠MCAO/R模型后神经元丢失数量[F(5,12)=42.55,p=0.0228,每组n=3]。与1h MCAO/R24h野生型小鼠组相比，ACVR1C受体敲除组小鼠大脑皮层神经元丢失数量增加[F(5,12)=42.55,p=0.0251,每组n=3]，在敲除受体的基础上给予激活素A，不能进一步减小1h MCAO/R24h神经元丢失数量。在TTC染色实验中也得到了类似的结果。野生型小鼠侧脑室注射激活素A可以减少1h MCAO/R24h野生型小鼠梗死面积[F(5,24)=54.71,p=0.0351,每组n=5]。相比野生型小鼠，神经元中ACVR1C受体敲除小鼠梗死体积更大[F(5,24)=54.71,p=0.0480,每组n=5],在此基础上给予激活素A并不能改善梗死面积。以上结果表明激活素A通过其ACVR1C受体抑制1h MCAO/R24h小鼠大脑皮层神经元自噬水平进而缩小其梗死面积。 综上所述，本研究发现，激活素A通过促进PI3K-PKB通路进一步抑制非经典自噬通路cGAS-STING,从而抑制缺血性卒中小鼠神经元过度自噬，保护缺血性卒中小鼠神经元，缩小其梗死面积并且改善其神经功能。研究结果为缺血性卒中治疗措施提供了新的科学依据，激活素A可能成为临床治疗缺血性卒中的新靶点。
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