摘要
板栗是我国大力发展的木本粮食树种，年产量居世界首位。其果实营养价值高，品质优良，市场需求较大，不仅可以助力农民增收，也为改善山区生态环境发挥了重要作用。然而在实际生产中，栗园面积大但产量低的问题始终存在。板栗为雌雄同株异花,雌雄花比例严重失衡，雄花过多不仅大量消耗了树体的营养，影响其生长发育，也限制了板栗的优质和丰产，制约了经济发展。以种子或果实为收获对象的经济林中，需要大量的雌花来提高产量。而最终决定产量的根本在于性别决定、配子体的分化、发育与成熟过程。因此挖掘性别分化的关键基因，明确性别调控的分子机制是目前雌雄异花植物的研究热点。课题组前期通过调查确定了板栗‘燕山红栗’性别分化的关键时期，因此本研究在此基础上利用存在二次开花现象的品种‘遵化短刺’，对整个性别分化时期的板栗雌雄花进行了广泛靶向代谢组、转录组与植物激素的测定，分析性别分化过程中的代谢物质变化、内源激素平衡及外源喷施植物生长调节剂后对板栗性别表现的影响;挖掘调控板栗性别分化过程中的关键基因，并对候选因子进行了初步的功能验证，以期为调节雌雄花比例提高板栗产量提供理论基础，同时对其他雌雄同株异花的木本植物性别调控具有重要的参考价值。最终取得了如下的结果: (1)‘遵化短刺’性别分化过程与雌雄花数量统计。河北地区‘遵化短刺’花芽在4月20日左右萌发，进入新梢旺长期后叶片面积与数量急剧增加，此时雄性葇荑花序首先出现在枝条下部，通常由5-7个小花构成一个雄花簇轮状互生。混合花序在5月中旬出现，刺状苞片逐渐开始形成，通常在两性花序基部的苞片内形成1-2个由3朵雌花聚生的雌花簇。通过调查与统计，两性花序上雌雄花簇的比例约为1:15-20;每个结果枝一般由1-3个双性柔荑花序和2-15个雄性柔荑花序组成，雌雄花簇的比例为1∶200-400;结果母枝包含1-9个双性柔荑花序和10-100个雄性柔荑花序，雌花簇和雄花簇的比例为1∶600-1000;最终单株雌雄花簇的比例可以达到1∶3000-5000。‘遵化短刺’二次梢每结果枝雌花量显著高于一次梢，从结果枝基部向上每节位都可能形成两性花序，结果枝雌雄花簇的比例约为1∶25-40。 (2)黄酮类物质含量可以影响板栗的性别分化。首先通过对板栗物候期的观察，从当年的4月份和7月份分别在不同部位采集花序从出现至开花期整个性别分化过程中的雌雄花，进行广泛靶向代谢组学测定。代谢组共检测到888种代谢物，包括128种脂质、77种有机酸、22种萜类、152种酚酸、57种生物碱、53种单宁、34种木质素和香豆素、154种黄酮类、88种氨基酸及其衍生物、50种核苷酸及其衍生物，以及72种其它类的化合物。雌雄花之间差异代谢物主要富集在类黄酮生物合成途径，Venn图确定了 22类类黄酮物质，包括柚皮素查尔酮、短叶松素、柚皮素、杨梅素与没食子儿茶素以及其它17种类黄酮衍生物，这些物质在雄花中含量显著高于雌花。其次，利用‘紫珀’和‘燕山早丰’两个品种进一步证明了在性别分化过程中，较高含量的黄酮物质有利于雄花的形成。外源喷施50 mg/L的柚皮素溶液使板栗结果枝与结果母枝雄花序分别减少了 44％与54％，结果母枝雌花簇与两性葇荑花序数量分别降低了 44％与47％。最终使得结果枝雌雄花簇比例增加了 34％，结果母枝雌花簇与雄花簇的比例增加了 24％。表明黄酮物质可作为植物生长调节剂抑制雄花发育，也可以部分抑制雌花的形成调节板栗花的雌雄比。 (3)CmAMS转录因子靶向调控类黄酮酶基因促进黄酮物质积累。基于转录组与代谢组联合分析的共注释通路为类黄酮生物合成途径，利用WGCNA筛选并构建了包括CmAMS在内的多个转录因子与7个类黄酮基因(CmCHS、CmF3''H和CmF3''5''H与CmDFR)以及5个黄酮物质的相关性网络图，最终确定CmAMS转录因子作为影响板栗性别分化的重要调节因子，并在‘紫珀’和‘燕山早丰’这两个品种中进一步确定候选因子在雌雄花发育过程中的重要作用。CmAMS-OE瞬时转化板栗组培苗增强了下游类黄酮酶基因的表达并提高了黄酮物质含量，其中CmCHS的表达量上升了 21倍，柚皮素含量增加了 5.8倍，酵母单杂试验与双荧光素酶试验证明CmAMS可以直接与类黄酮酶基因互作促进其表达。 (4)茉莉酸参与调控板栗的性别比例。植物激素共检测出脱落酸2种，生长素12种，细胞分裂素19种，乙烯类1种，茉莉酸8种，水杨酸2种，油菜素内酯1种，赤霉素7种。其中仅茉莉酸的前体物质OPDA是共同的差异激素。外源喷施200 mg/L的茉莉酸甲酯水溶液使结果枝雌花簇数减少了 35％,两性花序减少了 33％。结果母枝雌花簇与两性花序分别减少了 35％和16％,但增加了35％的雄花序。茉莉酸甲酯对‘遵化短刺’雌花有抑制作用但可以促进雄花的发育。植物激素与转录组联合分析筛选到3个茉莉酸信号转导途径上的MYC转录因子。其中一个编码MYC2转录因子的CmbHLH91基因与CmAMS表达趋势一致，并参与黄酮物质合成。 (5)联合转录组、代谢组和植物激素分析板栗二次花形成原因。转录组分析表明EREBP-like主要影响二次雌花的发育，HSP20主要影响二次雄花的发育。KEGG富集分析显示，147个共同的DEGs主要富集在植物-昼夜节律、类胡萝卜素生物合成、苯丙烷生物合成和植物激素信号转导途径。代谢组显示，雌花之间主要的差异代谢物是黄酮类和酚酸类物质，而雄花之间主要的差异代谢物是脂类、黄酮类和酚酸物质。这些DEGs和代谢物与二次花的形成呈正相关。植物激素的分析则表明，脱落酸和水杨酸可能与二次花的形成呈负相关关系。同时，MYB305可作为一个板栗性别分化的候选因子，影响黄酮类物质的合成而增加雌花的数量。
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