摘要
嗅神经母细胞瘤(olfactory neuroblastoma,ONB)最早在1924年由Berger报道，是一种罕见的鼻腔鼻窦恶性肿瘤，其发病率仅为0.4/100万，占所有鼻腔鼻窦肿瘤的2～3％。尽管进行了多学科团队的联合治疗，ONB的复发及死亡风险仍然较高。目前亟待进一步寻找治疗的分子靶点，将基因评估添加到病理诊断标准中，寻找更为合理的组织学分级标准，为ONB患者提供更好的治疗方案。 肿瘤细胞合成并释放大量的血管生成因子，作用于宿主的内皮细胞，形成新的血管，建立起肿瘤的血管网络，促进恶性肿瘤生长、浸润及转移。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管内皮细胞生长受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、金属基质蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)、金属基质蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP9)在恶性肿瘤血管生成中均起着重要的作用。微血管密度(microvessel density,MVD)是应用免疫组化技术对肿瘤血管进行半定量分析的指标，可量化反映肿瘤新生血管生成的程度。目前罕有文献报道MVD、血管生成因子尤其是多种血管生成因子与ONB临床病理特征及预后的关系。异柠檬酸脱氢酶2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)是三羧酸循环中参与细胞有氧代谢的酶家族之一，IDH2突变常见于急性髓系白血病和神经胶质瘤中，目前IDH2成为抗肿瘤治疗的新靶点，其在ONB中的研究很罕见。ONB中是否存在IDH2基因突变，其突变是否与MVD、血管生成因子、临床病理特征及预后相关，是否可以利用IDH2基因突变及血管生成因子将ONB进行分子分型，这些问题的解决可以为ONB的研究提供新的思路，为今后ONB的靶向治疗奠定理论基础。 研究目的： 本课题旨在通过检测ONB中MVD及多种血管生成因子的表达，比较MVD与多种血管生成因子、临床病理特征及预后之间的关系。同时检测IDH2基因突变情况、Ki67及神经内分泌标记物的表达，比较IDH2基因突变情况与临床病理特征、多种血管生成因子、Ki67、神经内分泌标记物及预后的关系，对ONB新生血管生成机制进行初步探讨，同时选择一些分子标记物评估ONB的预后并尝试将ONB进行分子分型。 材料与方法： 1.收集首都医科大学附属北京同仁医院近10年ONB病理检查标本82例，采用免疫组织化学方法检测CD31标记的MVD(CD31-MVD)、CD34标记的MVD(CD34-MVD)、CD 105标记的MVD(CD105-MVD)，分析三者与各临床病理参数及预后之间的关系，筛选出与预后相关的指标。 2.采用免疫组织组化和实时荧光定量PCR方法检测IDH2基因突变情况，采用免疫组化方法检测Ki67、CgA、Syn、NSE、CD56、S100表达。分析IDH2两种检测方法的差异性，分析其与临床病理参数、Ki67、CgA、Syn、NSE、CD56、S100及预后之间的关系。 3.采用免疫组织化学方法检测血管生成因子VEGF、VEGFR、MMP2及MMP9的表达，分析IDH2基因突变、MVD、各血管生成因子之间的关系。 结果： 1.ONB中CD105-MVD平均值在女性组明显高于男性组，在Hyams分级低级别组、Kadish低分期组均显著高于Hyams分级高级别组、Kadish高分期组(P＜0.05)。CD105-MVD与VEGF、VEGFR2表达呈正相关，与MMP9表达呈负相关(P＜0.05)。 2.ONB中CD31-MVD、CD34-MVD平均值在女性组明显高于男性组，在Hyams分级低级别组显著高于高级别组(P＜0.05)。CD34-MVD与VEGF、VEGFR2表达呈正相关(P＜0.05)。 3.CD31-MVD、CD34-MVD、CD105-MVD在ONB组织中的表达两两呈正相关(P＜0.05)。 4.VEGF在Hyams分级高级别组中的阳性率低于低级别组;MMP2、MMP9在Hyams分级高级别组中的阳性率高于低级别组，在Kadish分期高分期组中的阳性率高于低分期组，MMP2、MMP9两者之间呈正相关(P＜0.05)。 5.在ONB中低CD105-MVD组患者的总体生存率显著低于高CD105-MVD组患者(HR=3.309,95％CI：1.602-7.172,P=0.002)。Hyams 分级高级别组 ONB 患者的总体生存率显著低于低级别组患者(HR=0.280,95％CI：0.131-0.596,P=0.001)。 6.免疫组化染色方法显示19.51％(16/82)的ONB中IDH2蛋白胞浆阳性;实时荧光定量PCR检测显示18.29％(15/82)的ONB中IDH2突变，突变位点为IDH2的R172位点。两种检测方法共77例(93.90％)结果一致，5例(6.10％)结果不一致。两种方法经统计学分析比较，Kappa值为0.801。 7.实时荧光定量PCR检测显示IDH2突变仅发生在Hyams分级高级别组和高Ki67组中，Kadish分期低分期组中仅检测到1例IDH2突变。IDH2基因突变率在Kadish分期高分期组、Hyams分级高级别组、高Ki-67增殖指数组均显著高于Kadish分期低分期组、Hyams分级低级别组、低Ki-67增殖指数组(P＜0.05)。在女性组中未检测到IDH2基因突变，而在男性组IDH2基因突变率25％,两组相比具有统计学差异(P＜0.05)。IDH2突变组CgA、Syn、NSE、CD56、S100表达阳性率显著低于IDH2野生组(P＜0.05)。 8.IDH2基因突变组MMP2、MMP9的阳性率高于IDH2基因野生型组(P＜0.05)。IDH2基因突变与MMP2、MMP9相比较，差异具有统计学意义(r=0.363,r=0.393,P＜0.05)。 9.IDH2突变型患者的总生存率显著低于野生型IDH2患者;Hyams分级高级别组、高Ki67增殖指数组的总生存率均低于Hyams分级低级别组、低Ki67增殖指数组(P＜0.05)。Hyams分级高级别组中IDH2突变患者的总生存率显著低于IDH2野生型患者，远低于Hyams分级低级组患者的总生存率(P＜0.05)。高Ki67组中IDH2突变患者的总生存率低于IDH2野生型患者，远低于低Ki67组的患者总生存率（P＜0.05）。同时是Hyams分级高级别和高Ki67表达患者的总生存率低于Hyams分级高级别而Ki67低表达者，低于Hyams分级低级别而Ki67高表达者（P＜0.05）。 10.Cox多变量分析表明,IDH2基因突变和Hyams组织学级别是影响ONB患者预后的独立影响因子。 结论： 1.CD105-MVD能精确反映ONB微血管数量,可以作为判断其预后的有效指标。 2.CD105-MVD、CD31-MVD、CD34-MVD 对 ONB 的 Hyams 组织学分级具有重要的鉴别价值，MVD有望成为鉴别ONB组织学分级的重要客观指标。 3.VEGF和VEGFR2和CD105-MVD呈正相关，VEGF表达随着Hyams级别升高而下降，提示VEGF和VEGFR2在ONB早期肿瘤血管生成中起着重要作用。 4.MMP2和MMP9的阳性表达率随着Hyams组织学级别、Kadish分期升高而升高，提示MMP2和MMP9在ONB晚期肿瘤血管生成中起着重要的作用。 5.免疫组化方法和实时荧光定量PCR方法检测IDH2基因突变一致性较高，免疫组化方法是评估IDH2突变比较可靠、经济、便捷的检测方法。 6.IDH2突变型ONB具有典型的病理特征：CgA、Syn、CD56、支持细胞S100阳性表达率较低，具有高的Hyams分级、高的Kadish分期、高Ki67增殖指数。 7.IDH2突变型ONB预后较差，是影响ONB预后的独立因素，IDH2基因有望成为ONB分子分型及靶向治疗的标记物。IDH2基因联合Hyams组织学分级、Ki67增殖指数能更好的反映ONB的预后。 8.在高Hyams组织学分级、高Kadish分期的ONB中，更易检测到IDH2突变、MMP2与MMP9阳性表达，且IDH2突变与MMP2、MMP9正相关。这提示ONB肿瘤晚期的血管生成可能是通过IDH2突变后刺激肿瘤产生MMP2、MMP9实现的。
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