摘要
研究目的: 本研究通过对不同预后神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)患儿的临床特征进行分析，发现影响预后的独立危险因素;同时通过定量蛋白质组学的方法，对复发及未复发NB患儿的新鲜冰冻组织、石蜡包埋切片(formalin fixed and paraffin-embedded,FFPE)进行研究，鉴定复发与未复发患儿肿瘤组织间差异蛋白，筛选出与高危复发风险相关的潜在标志物，从而为预测NB预后提供更多依据，同时基于差异蛋白的信号通路分析结果，探索其致病机制，为寻求新的治疗靶点奠定基础。 研究方法: 1、选取2018年4月至2020年3月就诊于我院的腹部NB患儿200例，收集患儿的临床特征及预后状态，分析NB患儿的总体生存率，并根据预后情况将其分为快速复发组与三年稳定未复发组，回顾性分析两组之间的临床特征，发现影响NB预后的独立危险因素，并构建受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC曲线)评估其预测预后的准确性。 2、选取2017年1月至2022年2月入库我院标本库的NB冰冻组织，筛选出肿瘤组织成分在80％以上的样本，通过随访结果选取一年以内复发NB 7例，三年以上未复发NB 34例，采用数据非依赖采集(data independent acquisition,DIA)的蛋白质组学方法，对41例样本进行蛋白质定量分析，筛选出组间差异蛋白并对筛选到的差异蛋白进行功能富集分析。 3、选取2018年4月至2020年3月就诊于我院的高危腹部NB标本，筛选肿瘤组织成分在80％以上的FFPE样本，根据随访系统获得一年内复发6例，三年以上未复发14例，采用DIA定量蛋白质组学技术，鉴定出组间差异蛋白并对筛选到的差异蛋白进行功能富集分析。 4、将冰冻组织及石蜡切片筛选的差异蛋白进行对比，发现两组样本中共有的差异蛋白，并采用ROC曲线评估差异蛋白区分复发与未复发组别的效能，并构建用于复发风险预测的标志物组合。 研究结果: 1、通过对200例NB患儿研究发现，63例患儿出现复发进展，死亡患儿40例，其中85％患儿因复发进展死亡;在复发患儿中，90.5％患儿为高危组。复发进展组的3年及5年生存率分别为58.1％与41.7％;高危组患儿的3年及5年生存率分别为73.3％与60.9％。通过对NB患儿的临床特征分析发现，危险度分级为影响患儿复发的独立危险因素，其预测复发进展的准确率为0.821,特异性为67.7％。 2、对41例新鲜冰冻组织样本进行DIA定量分析，共鉴定到差异蛋白8181个。对差异蛋白进一步筛选后，最终得到高危组与复发风险相关的蛋白534个，其中上调蛋白366个，下调蛋白168个。对20例FFPE样本进行DIA定量分析，共鉴定到差异蛋白4602个。进一步筛选差异蛋白后，最终得到复发风险相关蛋白248个，其中上调蛋白141个，下调蛋白107个。 3、GO及IPA分析显示，高危复发风险相关蛋白主要集中在氧化磷酸化、线粒体功能障碍、吞噬体成熟、中性粒细胞陷阱、坏死信号通路、沉默基因、颗粒酶A、异种代谢PXR、异种代谢CAR、芳基烃受体通路、髓鞘形成通路等信号通路中。 4、将两组样本的差异蛋白进行比较后，共得到6个与高危复发风险相关的共同差异蛋白，分别为 Q9UPV7、Q86X02、Q9H6W3、P09543、Q8WUY8、P62072;其中P09543为下调蛋白，其余5个均表现为上调。ROC曲线分析发现，前5个预测复发准确率均高于危险度分级，其中Q9UPV7、Q86X02、Q8WUY8联合预测复发的准确率为0.989,提示蛋白联合具有较好的预测复发价值。 研究结论: 1、本研究中，高危组患儿最易出现复发进展，复发进展是患儿死亡的主要原因;复发组与高危组患儿的3年及5年生存率明显降低，高危复发是导致神经母细胞瘤生存率降低的主要原因;因此寻找高危复发风险标志物至关重要。 2、本研究表明，危险度分级可一定程度上预测NB复发，但是其特异性较低，相同危险度分级患儿的预后也存在差异，故在预测复发上仍存在一定的局限性;因此还需进一步寻找复发风险预测标志物，从而提高预测复发风险的准确性及特异性。 3、本研究采用蛋白质组学的方法，通过NB冰冻组织及FFPE样本共同鉴定到的6个差异蛋白可以很好地对NB复发风险进行预测，弥补危险度分级特异性不足的缺陷，同时相关靶标及功能分析结果也为下一步研究高危NB相关治疗方案奠定基础。
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